Tudomány, 1990, VI/6.
A polimeráz-láncreakció felfedezése

DNS-darabok elôállítása korlátlan mennyiségben, egy meglepôen egyszerû eljárás révén a gondolat valószínûtlen körülmények között, a kaliforniai hegyvidéken született meg egy holdfényes éjszakán

Írta: Kary B. Mullis*


Az embernek néha egészen váratlan pillanatokban jut eszébe valami jó gondolat. Naivitásom, egy-két szerencsés melléfogásom, meg a véletlenek összjátéka folytán 1983 áprilisában, egy péntek este támadt egy ötletem. Éppen Észak-Kalifornia hegyei felé autóztam a kacskaringós, holdfényes úton, amikor megfogalmazódott bennem az azóta polimeráz-láncreakcióként ismertté vált folyamat gondolata, amelynek lényege, hogy korlátlan számú génmásolat készítését teszi lehetôvé.

A genetikai információt hordozó DNS-molekula egyetlen példányából a polimeráz-láncreakció útján egy délután folyamán százmilliárd másolatot lehet elôállítani. A reakció egyszerû: nem kell hozzá más, mint egy kémcsô, néhány közönséges vegyszer és egy hôforrás. A másolandó DNS-minta lehet tisztított anyag, de lehet természetes állapotú, rendkívül összetett biológiai struktúrák parányi része is; származhat kórházi szövetmintából, hajszálból, a bûntett helyén talált beszáradt vércseppbôl, mumifikálódott agyszövetbôl, sôt akár jégbe fagyott, negyvenezer éves gyapjas mamutból is.

Az idõközben eltelt hét év alatt a polimeráz-láncreakció a biológiai tudományok nagyon sok területén polgárjogot nyert: különféle alkalmazásairól eddig több mint ezer közlemény jelent meg. Tulajdonképpen rejtély, hogy miért nem elôbb derült fény erre a tudományos szempontból nagy jelentôségû, ugyanakkor egyszerûen kivitelezhetô folyamatra, hiszen mindaz, ami szükséges hozzá, már több mint tizenöt évvel korábban rendelkezésünkre állt.

A polimeráz-láncreakció jócskán megkönnyíti a molekuláris biológiával foglalkozók dolgát: alkalmazásával annyit állíthatunk elô a kívánt DNS-bôl, amennyit csak akarunk. A DNS-molekulát szokás úgy emlegetni, mintha bármikor elô lehetne venni a hûtôszekrénybôl, holott a rendkívül egyszerû szerkezetû vírusokon kívül minden szervezetbôl nehéz eredeti formában DNS-molekulákat nyerni.

A nehézség a DNS-molekula természetében rejlik. Maga a molekula négyféle dezoxi-nukleotidból: dezoxi-adenilátból (A), dezoxi-timidilátból (T), dezoxi-guanilátból (G) és dezoxi-citidilátból (C) álló törékeny lánc, amelyben a genetikai információt a nukleotidok sorrendje hordozza. Egyszálú formában a DNS elég ritka; az egymást kiegészítô bázissorrendû DNS-szálak általában párt képeznek, és kettôs spirált hoznak létre, amelyben az egyik szál A nukleotidjai a másik T-jeihez kötôdnek, a G-k pedig a C-kkel kapcsolódnak. A sejtben a DNS kettôs spirálját különféle fehérjék veszik körül; hatásukra a DNS-molekula még inkább felcsavarodik. A rendkívül hosszú és vékony DNS-molekulákat igen nehéz tisztán kivonni a sejtbôl; már csekély nyíróerô hatására is darabokra törhetnek. Vonjuk ki akár ezernyi egyforma sejtbôl a DNS-molekulákat: a kívánt génbôl megkapjuk ugyan mind az ezer példányt, de az egyes példányokat a véletlenszerûen bekövetkezô törések folytán más és más DNS-darabok tartalmazzák.

Ez a probléma éveken át nagyon megnehezítette a gének tanulmányozását. A hetvenes években azonban felfedezték a restrikciós endonukleázoknak nevezett enzimeket, amelyek a DNS-szálat meghatározott pontokon hasítják el. Az endonukleázok segítségével a DNS-t már kisebb, stabilabb és könnyebben azonosítható részletekre lehetett darabolni, így a kívánt gént tartalmazó DNS-darabok kiválogatása is könnyebbé vált.

A hetvenes évek végén a biokémikusok már szorgosan vizsgálták a DNS-t az endonukleázok és az úgynevezett oligonukleotid szondák segítségével. Az oligonukleotidok rövid, meghatározott nukleotidsorrendû láncok, amelyek megfelelô körülmények között specifikusan kötôdnek az egyszálú DNS kiegészítô (komplementer) nukleotidszekvenciáihoz. A mesterségesen elôállított, radioaktív jelöléssel ellátott oligonukleotidok "keresômolekulaként", szondaként használhatók annak eldöntésére, hogy a vizsgált DNS-mintában jelen van-e valamely meghatározott gén, illetve nukleotidszakasz.
Ilyen oligonukleotid szondák elôállításával bízott meg 1979-ben akkori munkaadóm, a Cetus Corporation (Emeryville, Kalifornia). 1983-ra azonban az izgalmas, de meglehetôsen veszôdséges "kézi" oligonukleotid-szintetizálás átadta helyét a kevésbé igézô, ugyanakkor nagyon megbízható automatizált eljárásnak. Óriási elôrelépés volt ez, amelyet a szakmabeliek zöme, köztükjómagam is nagy örömmel üdvözöltem. Bennünket, nukleotidvegyészeket azonban ez a kisebbfajta ipari forradalom többé-kevésbé munkanélkülivé tett. Csak annyi dolgunk maradt, hogy feltöltsük és ellenôrizzük a laboratóriumi berendezéseket, amelyek szinte több oligonukleotidot gyártottak, mint amennyi a mélyhûtõben elfért mindenképpen többet annál, amennyit a molekuláris biológia minuciózus tudományának mûvelôi fel tudtak használni kísérleteikben.
Így azután laboratóriumomban a Cetus Corporationnél jócskán volt idôm elmélkedni és szöszmötölni. Egy idô után azon kaptam magam, hogy oligonukleotidokkal pepecselek...

Tudtam, hogy nagy szükség volna egy olyan eljárásra, amellyel azonosítani lehetne a DNS-molekulák meghatározott pontján levô nukleotidokat fôként a bonyolult DNS-molekulák, például az emberi DNS, illetve a kis mennyiségben rendelkezésre álló DNS-minták esetében jött volna jól egy ilyen módszer. Felvetôdött bennem a gondolat: mi lenne, ha a DNS-polimeráz enzimet és a DNS nukleotidsorrendjének meghatározására alkalmas, didezoxiszekvenálásnak nevezett eljárás egyik
változatát használnám erre a célra? Ötletem kipróbálására ki is találtam egy egyszerû kísérletet.

A kísérlet megértéséhez elôbb vegyünk sorba néhány fontos tudnivalót a DNS-molekulával kapcsolatban. A DNS-molekula egyik végét a kémia szóhasználata értelmében "háromvesszô (3'-) végnek", a másik végét "ötvesszô- (5'`-) végnek" nevezzük. A DNS kettôs spiráljában a két szál egymással ellentétes irányban fut: az egyik szál háromvesszô-vége a másik szál ötvesszô-végével áll párba, és viszont.

1955-ben Arthur Kornberg és munkatársai (Stanford Egyetem) felfedezték a késôbb DNS-polimerázoknak elnevezett sejtbeli enzimek egyikét. A DNS-polimerázok a sejtben többrendbeli feladatot látnak el; többek között részt vesznek a DNS-molekula kijavításában és másolásában. A különféle DNS-polimerázok tovább tudnak építeni bizonyos oligonukleotidokat, az úgynevezett "primereket" (indítószekvenciákat): új meg új nukleotidokat kapcsolnak azok háromvesszô-végéhez, de csak akkor, ha a primer elôzôleg hibridizálódik, azaz hozzákötôdik a szerkezetében neki megfelelô kiegészítô szál: a "templátként" (mintaként) szolgáló DNS-szál végéhez. Az oldatban természetesen jelen kell lenniük a DNS-molekula építôköveinek, a nukleozid-trifoszfátoknak.

A nukleotid, amelyet a polimeráz beépít, mindig a mintaként szolgáló templátszál soron következô bázisának kiegészítôje (komplementere). Ha a templáton mondjuk adenin (A) következik, akkor az új szálba timin (T) épül be; a guaninnal (G) szemben az enzim citozint (C) iktat a születô DNS-láncba. Ha semmi nem jön közbe, a polimeráz a folyamat ismétlésével a primer háromvesszô-végétôl eljut egészen a templát ötvesszô-végéig. A DNS kettôs spiráljának mindkét szála templátként mûködik a másik szál lemásolása vagy kijavítása során.

Most pedig néhány szót a didezoxiszekvenálásról, amelyet egyik felfedezôje, Frederick Sanger (British Medical Research Council, Molekuláris Biológiai Laboratórium) után Sanger-eljárás néven is emlegetnek. A módszer alkalmas a DNS nukleotidsorrendjének meghatározására, amennyiben rendelkezésre áll a DNS-polimeráz, a megfelelô templátok és primerek, valamint az egyes nukleozid-trifoszfátok és speciálisan módosított változataik, a didezoxi-nukleozid-trifoszfátok (ddNTP-k). A polimerázok a közönséges nukleotidokhoz hasonlóan a ddNTP-ket is hozzákapcsolják a növekvô lánchoz; a ddNTP-k azonban "pontot tesznek" a lánc végére ott, ahova bekapcsolódnak, mert megakadályozzák a további bázisok beépülését. A Sanger-eljárással így különféle hosszúságú, ddNTP-vel végzôdô DNS-darabokat kapunk. A felhasznált ddNTP-k ismeretében, a kapott láncokat hosszúság szerint sorba rendezve meghatározhatjuk a templátszál bázissorrendjét. Ha az új szálba például didezoxi-adenin (ddA) épült be egy bizonyos ponton, a templát megfelelô pontján nyilvánvalóan az adenin párja, a timin (T) foglal helyet; didezoxi-guanin (ddG) beépülése pedig a templátban citozin (C) jelenlétére utal.
Az eljárás általam kiötlött, módosított változatában csak polimerázra, templátra és primerekre volt szükség; a nukleozid-trifoszfátokat kihagytam a reakcióelegybôl. Így okoskodtam: a lánc növekedése azonnal befejezôdik, amint a végéhez egy ddNTP kapcsolódik; ha tudom, milyen ddNTP kötôdött a primerhez, máris azonosíthatom a templátszál megfelelô, a ddNTP bekötôdési helyével szemközti bázisát.

A DNS-SZÁLAKAT összekapcsolódott nukleotidok: dezoxi-adenilát (A). dezoxi-timidilát (T), dezoxi-guanilát (G) és dezoxi-citidilát (C) sorozata alkotja. A két szál nukleotidsorrendje komplementer, azaz kiegészíti egymást, mert az A-val szemben mindig T, a G-vel szemben pedig mindig C foglal helyet a láncban. Ez a komplementer szerkezet tartja össze a két szálat. Mindkét szálnak van egy "háromvesszô- (3'-) vége" és egy "ötvesszô- (5'-) vége", amelyek egymáshoz képest ellentétes helyzetûek, ezért antiparallelnek mondjuk ôket.

Akkor még nem tudtam, hogy szekvenálási eljárásom több okból sem mûködne. A fô problémát az okozza, hogy az oligonukleotidok néha nemcsak az általunk kiszemelt DNS-szakasszal hibridizálódnak, és így elkerülhetetlenül összezavarják az eredményeket. Az emberi DNS például már olyan hosszú, hogy még a leggondosabb hibridizálással sem lehet elegendô pontossággal hozzákötni az oligonukleotidokat egy-egy kiszemelt részletéhez, így bázissorrendjérôl ezzel a módszerrel aligha tudnánk meg bármi érdemlegest.


A POLIMERÁZ-LÁNCREAKCIÓ egyszerû eljárás, a szükséges vegyszerek pedig könnyen beszerezhetôk. A folyamat DNS-darabok laboratóriumi sokszorosítására alkalmas. A másolatokból alig néhány óra alatt már több mint százmilliárd példány jön létre.

Az emberi DNS-t vizsgáló kutatóknak körmönfontabb módszerekhez kell folyamadniuk. A DNS-mintát restrikciós enzimek segítségével különféle hosszúságú darabokra lehet szabdalni, és ezeket a kisebb DNS-darabokat azután elektroforézissel el lehet különíteni egymástól. Ezen az úton a vizsgálandó minta bizonyos mértékig "megtisztítható" az adott esetben érdektelen DNS-daraboktól. Ám még így is csak roppant nehezen értékelhetô adatokhoz juthatunk, ráadásul az eljárás hosszadalmas, és ha a DNS-minta sérült vagy denaturálódott, egyáltalán nem alkalmazható. Egy másik lehetôség a klónozás, amely azonban szintén idôigényesebb annál, semhogy a rutinszerû DNS-analízist lehetôvé tenné. Az emberi DNS vizsgálandó szakaszát a klónozás során egy plazmidnak nevezett kicsiny DNS-gyûrûbe "varrják bele". A plazmidot és vele a vizsgálandó DNS-t baktériumokban sokszorosítják, majd oligonukleotid-hibridizációval és didezoxi-szekvenálással meghatározzák bázissorrendjét. A nyolcvanas évek elején az emberi DNS különféle részeinek genetikai információtartalmát többnyire klónozott DNS-minták didezoxi-szekvenálása útján sikerült meghatározni.

Kísérletem megtervezésekor botor módon magától értetôdônek tekintettem, hogy egy emberi DNS-szakaszt egyetlen oligonukleotid hibridizációjával, mindenfajta klónozás vagy egyéb trükk híján is azonosíthatunk. Mentségemül szolgálhat, hogy Henry Erlich, a Cetus Corporation egyik tekintélyes kutatója munkacsoportjával abban az idôben szintén egy olyan eljárással próbálkozott, amely emberi DNS-szakaszok egyetlen oligonukleotiddal való hibridizációján alapult.

Egy májusi péntek estén éppen Mendocino felé autóztam; minden hétvégén felmegyek ugyanis északra, a vityillómba. Szeretek éjszaka vezetni, bár a 101-es út nem igényel sok figyelmet. A háromórás út alatt a kezem dolgozik, a gondolataim viszont szabadon kalandozhatnak. Azon a bizonyos éjszakán a DNS-szekvenálásról elmélkedtem.

Elképzelésem egyszerû volt. Elôször melegítéssel elkülönítem a vizsgálandó DNS két szálát, majd egy oligonukleotidot hibridizáltatok az egyik szál megfelelô szakaszával. A DNS-elegyet négy kémcsôbe osztom szét; mind a négy csôben jelen van a négyféle ddNTP, csak éppen az egyik csôben az egyik, a másikban a másik hordoz radioaktív jelölést. Ezután DNS-polimerázt adok az elegyekhez, amely minden kémcsôben egyetlen ddNTP-vel meghosszabbítja a hibridizálódott oligonukleotidot.

A következô lépésben elektroforézissel elkülönítem a meghosszabbodott oligonukleotidokat a maradék ddNTP-ktôl, aztán megvizsgálom, a négy közül melyik radioaktív ddNTP épült be az oligonukleotidokba; ebbôl már azonosítani tudom a vizsgált szál megfelelô, az illetô ddNTP-vel szemben beépült bázisát. Egyszerû, nem igaz?

A DNS-POLIMERÁZ nevti enzim képes bizonyos rövid DNS-szakaszok, úgynevezett oligonukleotid primerek meghosszabbítására, amennyiben azok valamilyen templáthoz, azaz hosszabb DNS-szakaszhoz kapcsolódnak. Az enzim a templát nukleotidjait kiegészítô (azokkal komplementer) nukleotidokat köt a primer háromvesszô-végéhez. Ha a nukleozid-trifoszfátok didezoxi-változatát, például didezoxi-adenozin-trifoszfátot (ddA) adunk az oldathoz, a primer nem hosszabbodhat tovább, mert a láncba beépülô didezoxi-adenilát (ddA) háromvesszô-végéhez szerkezeti okokból nem kapcsolódhat további nukleotid.

Cloverdale táján, ahol a 128-as út a 101-esbôl északnyugat felé ágazik, majd felkanyarodik a hegyek közé, eszembe ötlött, hogy módszerem egyértelmûbb eredménnyel szolgálhat, ha kétszálú DNS-t, és egyetlen oligonukleotid helyett mindjárt kettôt használok, olyképpen, hogy a két oligonukleotid primer háromvesszô-vége éppen közrefogja az azonosítani kívánt bázispárt. Amennyiben a két oligonukleotid eltérô méretû, meg is tudom különböztetni ôket egymástól; ha pedig az egyik oligonukleotidot a DNS-minta egyik szálához, a másikat pedig a másik szálhoz kötöm hozzá, a két szál bázissorrendjérôl egyidejûleg nyerhetek adatokat. A kísérlet így önnön kontrolljául is szolgál, és jócskán leegyszerûsödik.

Akkor még nem tudtam, hogy ezzel az  ötletemmel tehát azzal, hogy a vizsgált DNS-szakasz két szemközti szálához háromvesszô-végükkel egymás felé mutató oligonukleotidokat kötök már közel jártam a polimeráz-láncreakció felfedezéséhez. Mindössze arra ébredtem rá hirtelen, hogy még egy pillanat, és az útmenti árokban találom magam. . .

Az éjszakai levégô párával és a virágzó vadgesztenye illatával volt teli. Az út mellett egyre-másra fehér virágok dugták fejüket a fényszóró csóvájába. Miközben a "birtokomon" ásandó kis tavacskákon törtem a fejem, nem hagyott nyugodni a kérdés, hogy elvben megzavarhatja-e valami szépen eltervezett bázisszekvenálási kísérletemet.

Aspiránsként annak idején a Kaliforniai Egyetemen (San Francisco), Wolfgang Sadee laboratóriumában dolgoztam, méghozzá többek között John Maybaum társaságában, aki klinikai célú nukleotidkimutatási módszerek kidolgozásával foglalkozott. Még tõle értesültem arról, hogy a DNS-minták nyomokban tartalmazhatnak nukleozid-trifoszfátokat. Ez bizony tervbe vett kísérletemben jócskán megnehezítheti az elektroforézis értékelését, gondoltam, hiszen a mintával bevitt nukleotidok már a jelölt ddNTP-k hozzáadása elôtt hozzákapcsolódhatnak a primerek háromvesszô-végéhez.

Mi lenne, tettem fel magamban a kérdést, ha a minta szabad nukleozid-trifoszfátjait egy bakteriális enzimmel, az alkalikus foszfatázzal szabdalnám szét? Az enzim leválasztja a nukleozid-trifoszfátok reakcióképes foszfátcsoportjait, és ezzel megnyitja az utat a polimeráz-reakció elôtt. A mintát viszont ezután meg kell tisztítani a foszfatáztól, mielôtt az a ddNTP-ket is "megemésztené". A nemkívánatos enzimeket általában melegítéssel lehet hatástalanítani, mert hô hatására megváltozik a térszerkezetük, és így mûködésképtelenné válnak. Úgy gondoltam azonban, hogy a baktériumok alkalikus foszfatáza visszanyerheti eredeti formáját, tehát nem alkalmas a probléma megoldására.

EGY DNS-DARAB valamely bázispárjának azonosítására a szerzô a didezoxi-szekvenálásnak nevezett eljárás egy módosított változatát dolgozta ki. Elôször egy-egy primer kötôdik a DNS két szembenálló szálához, közrefogva a vizsgálandó bázispárt. Ezután DNS-polimerázt és didezoxi-nukleozid-trifoszfátokat (ddNTP) adunk az oldathoz. Így a primerek csak egyetlen bázissal hosszabbodhatnák meg. A lánchoz kapcsolódott ddNTP-k azonosításával megtudhatjuk, mi volt a kérdéses bázis. A kísérlet egyetlen primerrel is mûködik, de két primer egyidejû alkalmazása az eredmény ellenôrzésére is módot ad. Így jutott el a szerzô a polimeráz-láncreakció felfedezéséhez.

Mint kiderült, tévedtem. Csak jóval  késôbb tudtam meg, hogy amennyiben nincsenek cinkionok az oldatban,  az alkalikus foszfatáz hô hatására visszavonhatatlanul "elromlik" (denaturálódik). Tudatlanságom azonban mégis  áldásnak bizonyult, mert ha ismereteim  pontosabbak lettek volna, aligha nézek  jobb megoldás után.

Ahogy haladtam úticélom felé, mérföldrôl mérföldre újabb meg újabb lehetôségek jutottak eszembe és bizonyultak használhatatlannak. Közvetlenül az Anderson-völgy elôtt azonban támadt egy ötletem, amelyet takarékossági és esztétikai szempontból is tetszetôsnek találtam. Arra gondoliam, hogy ugyannzt az enzimet, a DNS-polimerázt kétszer is használhatnám: elôször a felesleges nukleozid-trifoszfátok eltávolítására, aztán a jelzett ddNTP-k beépítésére.

Így okoskodtam: ha a minta nukleotidtartalma elegendô ahhoz, hogy megzavarja a kísérletet, akkor ahhoz is elegendônek kell lennie, hogy a DNS-polimeráz számára építôanyagot szolgáltasson. Ha a ddNTP-k hozzáadása nélkül egy elôkészítô reakciót viszek végbe az oligonukleotid primerekkel és a polimerázzal, az elegyben található nukleotidok gyorsan "elfogynak", mert rögtön az oligonukleotidokhoz kapcsolódnak. A minta hevítésével azután a meghoszszabbodott oligonukleotidokat különválaszthatom a vizsgálandó DNS-tôl. Igaz ugyan, hogy e hosszabb oligonukleotidok továbbra is az oldatban maradnak, ám náluk sokkal nagyobb számban lesznek jelen a meg nem hosszabbodott primerek, így az elegy lehûlésekor a vizsgálandó DNS valószínûleg ezekkel a primerekkel hibridizálódik. Ezután hozzáadhatom az elegyhez a ddNTP-ket és még némi polimerázt, s a szekvenálási kísérlet immár akadálytalanul végbemehet.

Néhány kérdés azonban továbbra is nyugtalanított. Vajon az elôkészítô reakció során meghosszabbodott oligonukleotidok nem zavarják-e meg a késôbbi szekvenálási reakciót? Mi történik, ha az oligonukleotidokhoz nem pusztán egy vagy kettô, hanem sok bázis épül hozzá? Mi lesz, ha a meghoszszabbodás során olyan szekvencia jön létre, amelyen megkötôdhet a másik primermolekula? Ez bizony gondot jelentene. . .

De nem! Szó sincs róla! Egészen elállt a lélegzetem a felismeréstôl: a vizsgálandó DNS-szálaknak és a meghosszabbodott oligonukleotidoknak azonos lesz a bázissorrendjük! Az elôkészítô reakció tulajdonképpen megkettôzi a mintában a vizsgálandó DNS-molekulák számát! Hirtelen úgy tûnt, hogy a vadgesztenye illata exponenciális ütemben gyengül. . .

Más körülmények között talán nem ismertem volna fel ilyen hamar e megkettôzôdés jelentôségét ugyan mi érdekes lehet egy unos-untalan ismétlôdô folyamatban? Ám korábban sok idôt töltöttem számítógépes programok készítésével, közelebbrôl olyan ciklusokkal, amelyek valamilyen matematikai mûveletet ismételnek folyamatosan a megelôzô ciklusok eredményével. Tapasztalatból tudtam tehát, hogy milyen erôteljes ütemû az egymást követô megkettôzôdésekbôl adódó exponenciális növekedés; márpedig a DNS-másolási eljárás, amelyet kiötlöttem, éppen ilyen ütemû növekedést eredményezett.
Izgatottan kezdtem sorba venni a 2 hatványait: 2, 4, 8, 16, 32... Homályosan emlékeztem, hogy a 2 tizedik hatványa körülbelül ezer, vagyis a huszadik hatványa egymillió körül lehet. Az Anderson-völgy elôtti útelágazásnál leállítottam a kocsit, és a kesztyûtartóból papírt-ceruzát vettem elô; sürgôsen ellenôriznem kellett számításaimat! Utasom bágyadtan érdeklôdött, hogy miért álltunk meg, és minek gyújtottam fel a világítást, mire én izgatottan bizonygatni kezdtem, hogy valami fantasztikus dolgot fedeztem fel. Nem volt különösebb sikerem; ô újra elszenderedett, én pedig, miután meggyôzôdtem róla, hogy a 2 huszadik hatványa valóban egymillió fölötti érték, továbbhajtottam.

Körülbelül egy mérfölddel arrébb megint rájöttem valamire. Miután a primerek meghosszabbodása, a meghoszszabbodott termékek disszociációja, az új primerek megkötôdése és meghoszszabbodása néhányszor végbemegy, az exponenciálisan halmozódó DNS-szálak hossza egyszer csak nem nô tovább, mert végpontjuk helyét szigorúan meghatárorza, hogy hova esik a megkötôdött oligonukleotid primerek ötvesszô-vége. Az eredeti DNS-minta nagyobb darabjait tehát úgy lehetne sokszorosítani, hogy olyan primereket készítünk, amelyek egymástól távolabb hibridizálódnak a DNS-sel. A kapott darabok mindig meghatározott hosszúságú, jól elkülöníthetô egységek lennének.

Újból leállítottam az autót, és elkezdtem hibridizálódó, majd meghosszabbodó DNS-molekulákat rajzolni; a láncreakcióban minden ciklus terméke mintául szolgált a következô ciklus számára. Útitársam félálomban újból tiltakozott. "Nem fogod elhinni! Megáll az ember esze!" ujjongtam; ô azonban nem osztotta lelkesedésemet... Házikómat már további megállók nélkül értük el. Nehéz álmom volt azon az éjszakán: a fejemben minduntalan "dezoxi-ribonukleáris bombák" robbantak. . .

Reggel túl fáradtan ébredtem ahhoz, hogy el tudjam hessegetni a gondolatot: valaki, valahol már bizonyosan kipróbálta ötletemet. Kutatók ezrei foglalkoznak egyszálú oligonukleotidok polimerázokkal való meghosszabbításával; biztos, hogy valamelyiküknek már eszébe jutott a polimeráz-láncreakció. Ámbár ha valaki már megvalósította volna, biztosan publikálta volna az eredményeit, és a reakciót már régóta alkalmazná mindenki a DNS-darabok sokszorosítására.

Hétfôn bementem a laboratóriumba, és megkértem George McGregort, az egyik könyvtárost, hogy fussa át a számítógépben tárolt irodalmi adatokat a "DNS-polimeráz" címszó szerint. Semmi érdemlegest nem talált. A következô hetekben megírtam ötletemet mindenkinek, akit érdekelhetett; a címzettek egyike sem hallott róla, hogy bárki is próbálkozott volna ilyesmivel, egyikük sem látott okot arra, hogy ötletem ne lenne megvalósítható, ugyanakkor egyikük sem lelkesedett érte különösebben. A DNS-rôl alkotott elképzeléseimet mindig is sokan tartották fantazmagóriáknak, és nemegyszer megesett, hogy igazat kellett adnom nekik; most azonban úgy éreztem, hogy a nyomában vagyok valaminek. . .

Hónapok teltek el, míg elôkészítettem elsô kísérletemet, kipróbálandó, hogy a polimeráz-láncreakció mûködik-e. Ki kellett okoskodnom, hogy milyen pufferoldatot használjak, milyen legyen a reagensek egymáshoz viszonyított és abszolút koncentrációja, mennyire melegítsem fel és hûtsem le az elegyet, mennyi ideig tartson a reakció és így tovább. Kornbergnek a DNS-polimerázról írott elsô közleményeibôl indultam ki. A kísérlethez egy 25 bázispárból álló, plazmidba zárt DNS-darabot és két, 11, illetve 13 bázisból álló oligonukleotid primert választottam.

Amikor minden készen állt, elindítottam kísérletemet, mégpedig úgy, ahogy a legjobban szeretek kísérletezni: adva volt egyetlen kémcsô, a végeredmény pedig csakis "igen" vagy "nem" lehetett. Megsokszorozza-e a láncreakció a kiszemelt DNS-szekvenciát? Mint kiderült: megszokszorozza!

Amikor késô este hazaindultam, észrevettem, hogy Al Halluin, a Cetus szabadalmi ügyvivôje még a szobájában van. Bementem, és beszámoltam neki felfedezésemrôl, lefestettem elôtte a polimeráz-láncreakciót. A körülbelül száz ember közül, akinek eladdig hírt adtam a dologról, Al volt az elsô, aki jelentôséget tulajdonított neki, és azon melegében látni akarta a kísérleti eredményeket igazoló autoradiogramot.

Vannak, akiket nem gyôz meg egyetlen "kémcsôkísérlet", Al azonban nem tartozott közéjük. Még szobájában végighallgatta magyarázatomat, és elismerte, hogy jól hangzik. Most, a laboratóriumban már izgatott is lett egy kicsit; javasolta, hogy dolgozzak tovább a kísérleten, és jelentsem is be a szabadalmat, aztán gratulált és hazament.

A következô hónapokban egy ifjú és rendkívül tehetséges matematikus, Fred A. Faloona segítségével vizsgálgattam
és tökéletesítgettem a polimeráz-láncreakciót. Frednek ez volt a legelsô biokémiai jellegû munkája. A sikert sörrel ünnepeltük meg.

További néhány hónap alatt meggyôzôdtünk róla, hogy a polimeráz-láncrakció a plazmid-DNS nagyobb darabjainak sokszorosítására is alkalmas. Végül Henry Erlich laboratóriumából szereztünk némi emberi DNS-t, és bebizonyítottuk, hogy a láncreakcióval egyetlen génpéldány kiválasztott darabja is megsokszorozható.

A POLIMERÁZ-LÁNCREAKCIÓ ciklikus folyamat; a DNS-darabok száma minden ciklusban megkettõzôdik. A vizsgálandó kétszálú DNS szálait melegítéssel elkülönítjük, így hûlés közben primerek tudnak kötôdni hozzájuk. Ezután a DNS-polimeráz a megfelelô nukleotidok beépítésével fokozatosan meghosszabbítja a primereket, és végül létrejönnek az eredeti DNS-szálak pontos másodpéldányai.




A mai napig a polimeráz-láncreakció még sokat csiszolódott. Több, egymástól némiképp eltérô változata használatos: jómagam a DNS-minta 6098 Celsius fokos hômérsékleten való sokszorosítását tartom a legelônyösebbnek. A ciklusok ilyenkor csupán egy-két percig tartanak, a vizsgálandó DNS-molekulák száma pedig minden ciklusban megkettôzôdik. Az alkalmazott primerek általában 20-30 bázis hosszúságúak. A legfontosabb hatás, hogy a folyamatot egy hévforrásokban élô baktérium, a Thermus aqcuaticus DNS-polimerázával katalizáljuk. A korábban használt polimeráz ugyanis hô hatására könnyen tönkrement, ezért minden ciklusban pótolni kellett. A Thermus aquaticus DNS-polimeráza viszont magas hômérsékleten is stabil és mûködôképes, így elegendô a reakció kezdetén az elegyhez adni. Ezt a magas hômérsékleten mûködô polimerázt ma már génmanipulációval módosított baktériumokkal termeltetik.

A polimeráz-láncreakcióval elérhetõ, gyakorlatilag korlátlan génsokszorosítás példa nélkül állt., ezért a tudományos közvélemény nem könnyen "emésztette meg". Senki nem számított arra, hogy létezik olyan folyamat, amellyel mindenféle DNS korlátlan mennyiségben elôállítható. Frednek és nekem pofonegyszerûnek tûnt a reakció, hiszen annyit játszadoztunk vele; a többi kutatónak azonban idô kellett, hogy hozzászokjon a láncreakció gondolatához.

Miközben a szabadalmon dolgoztam, 1984-ben egy poszteren is beszámoltam a polimeráz-láncreakcióról a Cetus Corporation évente megtartott tudományos ülésén. A Cetusnál elsôrangú tudósok dolgoznak, így alig vártam, hogy felfedezésemet megoszthassam velük.

Ám senki nem mutatott érdeklôdést poszterem iránt: csak ránéztek,  aztán továbbmentek én meg egyre jobban feszengtem. Végül észrevettem Joshua Lederberget, a Rockefeller Egyetem elnökét, és odacsaltam, hogy ugyan nézze már meg az eredményeimet. Josh  gondosan végigböngészte a posztert, majd felém fordította azt a hatalmas, Nobel-díjas fejét, amelybôl 1946-ban kipattant a baktériumok nemi közösülésének gondolata. "És ez mûködik is?" kérdezte évôdve.

Örömmel kezdtem magyarázni, hogy igen, mûködik, aztán még hosszan beszélgettünk. Josh megemlítette, hogy körülbelül húsz évvel azelôtt, amikor Kornberg felfedezte a DNS-polimerázt, mindkettejüknek eszébe jutott, hogy az enzimet valahogyan a DNS sorozatgyártására is be lehetne fogni, de nem jöttek rá, hogyan. Emlékeztettem rá, hogy akkoriban még nem volt gyerekjáték oligonukleotidokhoz jutni, és jóformán egyetlen DNS-szekvencia sem volt ismert.

Josh ekkor újra a poszterra nézett, ezúttal már majdnem olyan arckifejezéssel, amilyet vártam tôle. Azt hiszem, ô volt az elsô, aki a polimeráz-láncreakció végtelen egyszerûségét látva azt érezte, ami ma már szinte minden DNS-kutató legelsô gondolata: "Hogyhogy ez nekem nem jutott eszembe'?!" Fogalmam sincs, miért éppen bennem fogamzott meg a gondolat egyszerûen belebotlottam egy májusi éjszakán.



*Kémiai Nobel-díj,1993.


Kémiatörténet
Elõadó
http://www.kfki.hu/chemonet/