Horacsek Márta:
A gliadin kimutatása élelmiszerekben
Országos Élelmezés- és Táplálkozástudományi Intézet, 1995
 

A gabonafélék ősidőktől fogva nagy szerepet játszanak a humán táplálkozásban. Napjainkban a föld lakossága energia-bevitelének mintegy 50 %-a, a fehérjebevitelének pedig 45 %-a cereáliákból származik. A cereáliák egyben fontos vitamin-, ásványi anyag- és komplex szénhidrát források, beleértve az élelmi rostokat is.

A cereáliák közül ma is az egyik legértékesebb és legnagyobb területen termelt gabona a búza. A búza és rizs együttesen, az emberiség táplálkozásában az összes energia 40 %-át, a fehérjéknek pedig közel 40 %-át adja.

Egy szűk csoport számára néhány gabonaféle (búza, rozs, árpa, zab, triticale, esetenként a hajdina, köles, cirok) fogyasztása súlyos egészségi problémák okozójává válhat. A betegséget gluten szenzitív enteropathianak, vagy coeliakianak nevezik. A coeliakia egész életre szól, gyermek és felnőtt korban egyaránt manifesztálódhat. A betegség megjelenési formáját illetően igen heterogén, a klasszikus esetek mellett ma már csendes, sőt látens esetek is ismertek. Ez utóbbiak diagnosztizálása nehéz, de szükségszerű feladatot jelent az orvosok számára.

A coeliákia pathomechanizmusa még ma sem ismert, de az már bizonyított, hogy a búza, rozs, árpa, zab, triticale alkohololdható frakciói a prolaminok a felelősek a bélnyálkahártya elváltozásokért. Tekintettel arra, hogy a felsorolt cereáliák közül a búzának van a legnagyobb szerepe a humán táplálkozásban, a kutatások túlnyomó része a búza prolaminjára, a gliadinra irányul. A gliadin és a sav-, és lúgoldható glutenin alkotja a búza sikért, vagyis a glutent. A búza gluten frakcióján belül a gliadinok és gluteninek egymáshoz viszonyított aránya 1:1. A gliadin kifejezés mellett gyakran használják a gluten megnevezést is. Ez nem tekinthető hibának, különösen ha azt vesszük figyelembe, hogy a gluten egyik komponense a gliadin, így a gluten hiány egyben gliadin hiányt is jelöl. Ezenfelül a két frakció az oldhatóság alapján sem különíthető el élesen egymástól, ugyanis az alacsonyabb móltömegű gluteninek szintén oldódnak vizes etanol oldatban. A gluten, illetve gliadin szó használata elterjedt még a coeliákia szempontjából kritikus gabonafélék prolaminjaival kapcsolatban is, bár ezeknek külön megnevezése is ismeretes (pl. rozs-szekalin, árpahordein, stb.).

A gluten szenzitív enteropathiás betegek teljes értékű emberi életet élhetnek, amennyiben a számukra előírt glutenmentes étrendet megtartják. Megfelelő glutenmentes étrenddel nem csak az akut esetek tünetei szüntethetők meg, hanem megelőzhetők a betegséghez társuló egyéb szövődmények, amelyek közül legsúlyosabbak a daganatos betegségek.

A glutenmentes étrend megtartása nem könnyű feladat, ugyanis az étrendből nem csak a gluten tartalmú cereáliákat (búza, rozs, árpa, zab, triticale, esetenként köles, cirok, hajdina), hanem a belőlük származó, magasabb feldolgozottsági fokú anyagokat (pl. keményítő ) is eliminálni kell. Ez utóbbiak gyakran alig azonosítható módon, teljesen váratlanul is megjelenhetnek feldolgozott élelmiszereinkben. A betegek az étrendjüket glutent eleve nem tartalmazó élelmi anyagokból (gluten-free by nature), glutent nem tartalmazó un. normál élelmiszerekből és a kifejezetten számukra előállított glutenmentes készítményekből építhetik fel.

A glutenmentesség fogalmára vonatkozó újabb és újabb definíció tervezetek jól tükrözik a gluten, illetve a gliadin kimutatására irányuló módszerek fejlődését, de tekintettel arra, hogy még ma sincs általánosan alkalmazható, elfogadható módszer a gliadin mennyiségi mérésére élelmiszerekben, jelenleg is az 1981-es Codex Alimentarius Standard van érvényben. Ezt az előírást veszi figyelembe a jelenleg hatályos hazai Élelmiszertörvény, illetve a végrehajtására kiadott rendelet. Eszerint "Glutenmentes élelmiszernek az a készítmény minősül, amely búzát, rozsot, árpát, zabot, vagy ezekből származó élelmiszer nyersanyagot nem tartalmaz. A glutentartalmú cereáliákból származó össznitrogén-tartalom a szárított termékre vonatkoztatva nem haladja meg a 0,05 g/100 g-ot." Az előírás hibája, hogy a határérték csak a keményítők, illetve származékaik esetén hozható összefüggésbe a glutentartalommal, ugyanis más esetekben nincs megfelelő módszer a fehérjék eredetének azonosítására.

Figyelemmel arra, hogy a gluten/gliadinmentes élelmiszerek, valamint a coeliákiás betegek által fogyasztott egyéb élelmiszerek gluten/gliadin-tartalmának ellenőrzése fontos, de még ma is megoldatlan feladat, célul tűztem ki egy laboratóriumi körülmények között egyszerűen kivitelezhető, kis vegyszer- és műszerigényű módszer kidolgozását az élelmiszerek gliadin-tartalmának, illetve a glutenmentes élelmiszerek esetleges gliadin szennyeződésének kimutatására.

Kísérleteimet a búza gliadin detektálására összpontosítottam, tekintettel arra, hogy a betegség szempontjából kritikus gabonafélék közül a búzának van a legnagyobb jelentősége a humán táplálkozásban.

Módszerem alapját a fehérjék móltömeg szerinti elválasztása az SDS-PAGE képezi. Ezen belül a módosított LAEMMLI (1970) diskontinuus puffer rendszert adaptáltam a gliadin élelmiszerekben történő kimutatására.
 

Munkám során elemeztem a vizsgálatok eredményét alapvetően befolyásoló kivonatkészítési, előkészítési eljárásokat. Ennek eredményeként megállapítottam:

1. A 40-70 %-os etanol megfelelő extraháló szere a gliadinnak, illetve a többi gabona prolaminnak. Figyelembe kell venni azonban azt, hogy a búza gliadinnal ellentétben a többi vizsgált gabonafélénél (rozs, zab, árpa, rizs, kukorica) az SDS-PAGE kép a kivonásra használt etanol koncentrációjának függvényében változik. Ennek megfelelően az anyagok összehasonlító -elemzéséhez csak azonos koncentrációjú etanollal nyert kivonatok használhatók. A feltárt különbségek egyben lehetőséget adnak arra is, hogy egy termék alapkomponensének ismeretében olyan koncentrációjú etanol oldatot használjunk, hogy az alapkomponens zavaró hatása minél kevésbé érvényesüljön. Példa erre a kukorica, amelynek 70 %-os etanolos kivonatában 43.000 és 37.000 móltömegű frakciók is vannak, amelyek viszont megnehezíthetik a búza gliadin azonosítását, különösen, ha az igen kis mennyiségben van jelen. Ez a frakció a 40 %-os etanolos kivonás esetén nincs jelen detektálható mennyiségben, vagyis kukoricaliszt gliadin szennyezésének kimutatásánál mindenképpen a 40 %-os etanol, mint extrahálószer használata javasolt.

 
2. A zsírtalanítás gabona- és sütőipari termékek esetén elhagyható, mivel nincs hatással az SDS-PAGE képre még magasabb zsírtartalmú (30 %) termékeknél sem. Alacsony, 10 %-nál kisebb zsírtartalmú anyagoknál (pl. búzaliszt) még veszteségeket is okoz, különösen a 100.000 - 88.000 D móltömegű omega gliadinok körében.

 
3. A dialízisnek elválasztást javító hatását a nem hőkezelt gabonaipari termékeknél egyáltalán nem tapasztaltam. A hőkezelt gabona- és sütőipari termékeknél a dialízis alkalmas volt a vízoldható zavaró komponensek (pl. cukor, egyes Maillard reakciós termékek) 80-85 %-ban történő eltávolítására, de ezzel csak az elválasztás élessége volt javítható esetenként, a gliadin kimutathatósága viszont ettől lényegesen nem módosult.

1. Az SDS-PAGE elválasztáshoz 4, vagy 5 %-os gyűjtő, és 10, vagy 12 %-os elválasztó gél a legmegfelelőbb. A futtatásoknál a 10 °C-os külső hőmérséklet, a feszültség stabilizálása (40 V, max. 24 mA a minta gyűjtő gélbe történő bejutásáig, 100 V, max. 45 mA az elválasztás végéig) és a kb. két órás futtatási idő volt a legkedvezőbb az elválasztás minőségére.

 
2. A gélek hosszabb ideig (36 óra) tartó festése (festékoldatban való áztatása) szintén javította az SDS-PAGE képet. Sürgős esetekben természetesen megfelelő kép nyerhető 12 órás (egy éjszaka) festéssel is.

 
3. Az alkalmazott előkészítési, futtatási és festési eljárások mellett, a módszerrel 0,5-1 mg gélre felvitt gliadin még detektálható.

1. A különböző búzafajták, valamint lisztjeik és magjaik SDS-PAGE képei között kis eltérések ugyan tapasztalhatók, de az elektroforetikus képek minden esetben karakterisztikusak, a búza gliadinok azonosítására alkalmasak. Az említett kép alapján a búzacsíránál és korpánál is bizonyítható a búza eredet.
2. A humán táplálkozásban használatos egyéb gabonafélék prolaminjainak SDS-PAGE képe fajspecifikus, lehetőséget nyújt a fajok egymástól való megkülönböztetésére.
3. Az alkalmazott módszerrel a coeliákiások által használt lisztekben, és a számukra készülő törzskönyvezett glutenmentes lisztkeverékekben 0,2-0,5 % "búzaliszt szennyeződés", az adott búzaliszt fehérjetartalmával számolva 10 - 20 mg gliadin/100 g szárazanyag mutatható ki. E tekintetben a módszer érzékenysége gyakorlatilag eléri a Codex Alimentarius Standard for Gluten-free foods 1995-ös tervezetében, a glutenmentes élelmiszerek glutentartalmának megengedhető felső határát (200 ppm gluten, azaz 10 mg gliadin/100 g szárazanyag). A coeliákiások által használt lisztek és a részükre készülő glutenmentes lisztkeverékek ellenőrzése alapvető fontosságú feladat, hisz a betegek többnyire ezeket a készítményeket használják az általuk fogyasztható kenyerek, sütemények és egyéb ételek elkészítéséhez. Magyarországon egy termék glutenmentességére jelenleg csak a gyártási körülmények és a felhasznált anyagok specifikált glutenmentessége ad megfelelő garanciát. Az általam beállított módszer lehetőséget kínál a laboratóriumi ellenőrzésre is az említett lisztek esetében. A leírt módszer beállításánál az egyszerűség, könnyű kivitelezhetőség mellett a továbbfejleszthetőség is szempont volt, vagyis a módszer érzékenysége és a szelektivitása új festési eljárásokkal (ezüst festés, immunperoxidáz festés) véleményem szerint tovább növelhető.

1. A gliadin kimutathatósága hőterhelés hatására csökken. Ez összefügg a gliadinok hő hatásra bekövetkező denaturációjával/degradációjával/aggregációjával, ami alapvetően megváltoztatja az oldhatóságot. Eredményeim alapján, hőkezelt lisztekből 40 %-os etanollal több extrakt nyerhető, mint 70 %-os etanollal. 40 %-os etanol használatával és dialízis alkalmazásával a kimutathatóság felső határai (60 perc-190 °C; 5 perc-210 °C) sem időben, sem hőmérsékletben nem terjeszthetők ki, csak az elválasztás minőségében tapasztalható némi javulás.
2. A pelyhesített, puffasztott, valamint extrudált termékek vizsgálatával kapcsolatban elmondható, hogy a pelyhesítés "rongálja" legkevésbé a gliadinokat. Az extrudálás önmagában nem sokat ront a kimutathatóságon, de az ízesítés művelete - amely magában foglalja a felhasznált ízesítő anyagokat és a technológiai eljárást is (pl. karamellizálás) erős gátló tényezőnek bizonyult. A puffasztás "romboló" hatása a legnagyobb, ami a rövid idejű (30 s), de igen magas hőbehatással (270-290 °C) magyarázható.
3. Sütés, főzés hatására a gliadin kimutathatósága szintén csökken a sütő- és tésztaipari termékekben, de a búza gliadin jelenléte minden esetben azonosítható. A változások egyértelműen nem csak az alkalmazott hőbehatással és annak idejével magyarázhatók, hanem az egyes élelmiszeralkotók (nedvesség, tojás, cukor, keményítő) jelenlétével és azok gliadinnal való kölcsönhatásával is.
4. A puding, piskóta és virsli modellek vizsgálata választ adott arra, hogy a fent említett komponensek milyen mértékben csökkentik a gliadin kimutathatóságát a vele való kölcsönhatásból, illetve abból adódóan, hogy bizonyos móltömegű alkohololdható frakciói egybeesnek a gliadin azonosítását elősegítő 30.000 - 50.000-es móltömegű fehérjékkel.

A vízzel készült pudingban ( 92 % nedvességtartalom ) a nedvesség és a hő együttes ráhatásaként 100 g szárazanyagban 48 mg-ra csökkent a gliadin kimutathatósága. Ugyanez az érték a 92 %-os tejhányadú pudingban 106-213 mg. A vizes puding cukros változatánál, ahol a cukor dialízissel 80 - 85 %-ban eltávolítható volt a nedvesség, a cukor és a hőterhelés együttes ráhatásaként ismételten nőtt a még kimutatható gliadin mennyisége 137-343 mg gliadin/100 g szárazanyag. A tejes cukros pudingnál 100 g szárazanyagra számolva 252 mg gliadin még detektálható, bár itt meg kell jegyezni, hogy az előző modellnél említett, felső értékhez viszonyított csökkenés relatív, csak szárazanyagtartalom növekedésének tudható be. A piskótánál az 52 %-ban jelenlevő tojás alkohololdható fehérjéi teljes mértékben uralják az elektroforetikus képet, így csak a 100 % búzaliszttel készült mintánál látható a búza gliadin jelenléte. A baromfi virsli modellnél a csirkehús és a hőkezelés együttes eredményeként 100 g szárazanyagra számolva 75-150 mg gliadin mutatható ki.
5. A fentiek alapján a módszer érzékenysége a hő és a különböző élelmiszer alkotók egymásra hatásaként csökken, így 'hőkezelt termékekben csak a Codex Alimentarius tervezetben megjelölt 10 mg gliadin/100 g szárazanyagot nagyobb mértékben meghaladó "gliadin szennyeződés"-ek detektálására alkalmas. Megjegyzem, hogy a módszer a vizes pudingnál és a virslinél eléri, a tejes, valamint a vizes-cukros pudingok esetében pedig megközelíti a még érvényben levő 1981-es Codex Alimentarius előírás követelményét, mely a 0,05 g N/100 g szárazanyag tartalomnak megfelelően 120 mg gliadint enged meg a glutenmentes termék 100 g szárazanyagában. Zsírtalanítással, vagy dialízissel az érzékenység a hőkezelt termékek esetén sem növelhető, csak az elektroforetikus kép minősége javítható némileg.

A matematikai statisztikai értékelés alapján a módszer, illetve a mérés megbízhatóan, jól reprodukálható.