Zsarnóczay Gabriella:
Egyes, húsban előforduló enzimek hőinaktivitásának tanulmányozása és alkalmazhatósága a minőségellenőrzésben
Budapesti Műszaki Egyetem

A dolgozat keretében a húskészítmények főttségének ellenőrzésére alkalmas enzimes módszereket tanulmányoztam, majd vizsgáltam ezek alkalmazhatóságát a minőségellenőrzésben.
 

A kísérleti munka eredményei az alábbi pontokban foglalhatók össze.
 

1. A húskészítmények főttségének megállapítása a legpontosabban az enzimaktivitás mérésével történhet. A módszer alapja, hogy a húsban lévő különböző enzimek hő hatására inaktiválódnak és a főzés utáni maradék enzimaktivitás összefügg a hőkezelés mértékével. Ennek ellenőrzésére azonban csak olyan enzimek jöhetnek szóba, amelyek az előírt hőkezelés után is még jól mérhető enzimaktivitást mutatnak. Az "API ZYM" rendszerrel (MONGET, 1978) meghatároztam a hőkezelt sertéshúsban lévő enzimeket, melyek alapján kiválasztottam a megfelelőnek tűnő két enzimet, a savanyú foszfatázt és a laktát dehidrogenázt.
2. A következő lépésben a két kiválasztott enzim aktivitásának húskészítményekből történő meghatározási módszereivel foglalkoztam.
• a. A jelenleg elfogadott és alkalmazott módszer a savanyú foszfatáz aktivitását határozza meg. A módszer lényege, hogy az enzim a szubsztrátumként alkalmazott dinátrium-fenil-foszfátból fenolt szabadít fel, amely 2,6-dibróm-kinon-4-klórimiddel reagáltatva kék színű indofenol vegyületet képez, melynek mennyisége spektrofotometriásan mérhető. Az amerikai ellenőrző szervek által elfogadott LIND-féle módszert KÖRMENDY és munkatársai (1992), az optimális mérési paraméterek meghatározásával módosították. Ez a módosított foszfatáz próba a LIND-féle eljárásnál mintegy négyszer érzékenyebb.

A savanyú foszfatáz aktivitása a húskészítményekben azonban más szubsztrátummal is meghatározható, ilyen pl. a p-nitro-fenil-foszfát, melyet a klinikai diagnosztikában, vérszérumok vizsgálatára elterjedten alkalmaznak. Az enzim a reakció sorár a p-nitro-fenil-foszfátot p-nitro-fenollá hidrolizálja, amely lúgos közegben sárga színű, így mennyisége színkialakító reagens nélkül, spektrofotometriásan közvetlenül mérhető.
Ez utóbbi módszert húskészítmények vizsgálatára adaptáltam. Nehézséget okozott azonban az, hogy — ellentétben a vérszérummal — a reakció hetegén fázisban játszódik le. Így tehát a fotometriás mérés előtt feltétlenül szükséges, hogy víztiszta, opaleszcencia nélküli oldatokat nyerjünk. A vizsgálandó húskészítmény nagy fehérjetartalma miatt az enzimreakció leállítására használt nátrium-hidroxid-oldat a rendszerben jelenlévő fehérjét nem képes tökéletesen eltávolítani. A megmaradó fehérje pedig a szűrlet opálosságát, zavarosságát eredményezi, ami a fotometriás mérést lehetetlenné teszi. Ezért a fehérjéket a szűrés előtt triklór-ecetsavval ki kell csapni. A kicsapás után a szűrlet már tiszta és átlátszó.
A módszer átdolgozása után elkészítettem a p-nitro-fenol kalibrációs görbéjét, melyet a fenol kalibrációs görbéjével hasonlítottam össze. A fenolgörbe meredekebb mint a p-nitro-fenol, tehát a koncentrációváltozásra érzékenyebb. Ugyanerre az eredményre jutottam az érzékenységi hányados alapján történő érzékenység-vizsgálattal is, ahol 3 különböző hőkezelésű sonkamodell foszfatázaktivitását határoztam meg a szubsztrátumként dinátrium-fenil-foszfátot, illetve p-nitro-fenil-foszfátot alkalmazó módszerekkel.
Az eredmények alapján megállapítható, hogy a p-nitro-fenil-foszfát szubsztrátumot alkalmazó foszfatázmeghatározási módszer fele olyan érzékeny, mint a dinátrium-fenil-foszfát szubsztrátumot használó módosított foszfatáz próba. Az előbbi módszer egyedüli előnye, hogy a szűrlet lúgosítás után, színreagens hozzáadása nélkül spektrofotométeren közvetlenül mérhető.
• A laktát dehidrogenáz szintén jelentős aktivitással rendelkezi a nyers húsban. Az aktivitás meghatározásának alapja, hogy az enzim a piruvátot NADH jelenlétében laktáttá alakítja. A reakció a NADH fogyásával követhető nyomon, a spektrofotométeren mért abszorbancia-változás alapján. A mérés feltétele — a közvetlenül a küvettában lejátszódó enzimreakció miatt — a homogén fázis. A laktát dehidrogenáz aktivitásának meghatározása elsősorban vérszérumból történik. Ezért első lépésben húskészítmények vizsgálatára dolgoztam át a módszert. Először meghatároztam az optimális mérési paramétereket, melyek a következők: foszfátpuffer koncentrációja = 0,05 mol/dm³; foszfátpuffer pH-ja = 7,50; NADH-koncentráció = 9 mmol/dm³; piruvátkoncentráció = 35 mmol/dm³. A méréshez csak a hússzuszpenzió centrifugálás utáni felülúszója használható. Ez azonban azt jelenti, hogy feltehetően nem az össz-aktivitást mérjük, hiszen az főleg a csapadékhoz van kötve, hanem annak csak egy bizonyos hányadát. Ez a tény is jelentősen rontja a módszer érzékenységét. Az érzékenységi hányados értéke 0,52, vagyis a módszer fele olyan érzékeny mint az összehasonlításul szolgáló módosított fosztatáz próba.

Ezek után meghatároztam a laktát dehidrogenáz hőinaktiválódását. A 70 ^oC-on 45 perces hőkezelést kapott sonkamodell már nem mutatott mérhető enzimaktivitást. Az elégséges hőkezelés eléréséhez pedig 70 ^oC-on 80 perc szükséges. Mivel a laktát dehidrogenáz az ilyen hőkezelést kapott termékeknél már nem mutatható ki, ezért a módszer ebben a tartományban nem alkalmas a húskészítmények főttségének ellenőrzésére.
Az eddigi eredmények alapján megállapítottam, hogy a hőkezelés ellenőrzésére a vizsgált módszerek közül a módosított foszfatáz próba a legalkalmasabb. Ez ugyanis az összes többi vizsgált módszernél érzékenyebb, illetve a savanyú foszfatáz viszonylag hőtűrő enzim (80 ^oC-on törfénő 40 perces hőkezelés után is még mérhető foszfatázaktivitás van a termékben).

3. A továbbiakban vizsgáltam a húskészítmények főzés utáni, maradék foszfatázaktivitását befolyásoló tényezőket.

• Egy termék maradék aktivitását természetesen a kezdeti aktivitás befolyásolja. Meghatároztam tehát a húskészítmények gyártása során felhasznált különböző alapanyagok (sertéshús, marhahús, ipari szalonna, ín, bőrke és vérplazma) és nem húseredetű fehérjék (tej- és szójafehérje) saját foszfatázaktivitását. A vizsgált anyagok közül a legnagyobb foszfatázaktivitással a sertés-, illetve marhahús rendelkezik, az ín és ipari szalonna foszfatázaktivitása a húsénak csak kb. 20 %-a, míg a bőrke, vérplazma és a nem húseredetű fehérjék foszfatázaktivása a húshoz képest elhanyagolható. Amennyiben ezen idegen fehérjék adagolása a húskészítményekben a víz rovására történik, a termék kezdeti foszfatázaktivását nem befolyásolják. Ezeket anyagokat azonban általában hús helyettesítése céljából alkalmazzák, ebben az esetben pedig a termék kezdeti foszfatázaktivitása már mintegy 20 %-kal csökken.
• A húskészítmény maradék foszfatázaktivitásának kialakulásában a különböző anyagok, az eltérő hőtűrésük miatt szere játszhatnak, miután bennük a foszfatáz, azonos hőkezelés esetén, eltérő mértékben inaktiválódik. Ennek vizsgálata párizsimodellben történt. Az eredmények alapján megállapítottam, hogy az ín, tejfehérje, vérplazma, laktát, karragenát, keményítő, polifoszfát, konyhasó, aszkorbinsav és dextróz a foszfatáz tűrését nem befolyásolja, míg a szójafehérje csökkenti, a bőrke pedig növeli azt.
• A foszfatázaktivitás mérésénél az enzimreakcióban keletkező fenolt 2,6-dibróm-kinon-4-klórimiddel reagáltatva kék színű indofenol vegyület keletkezik, melynek mennyiségét spektrofotométerrel mértük. A kialakuló kék színt azonban néhány szerves vegyület ( főleg aromakomponensek ) befolyásolja, melyek a színreagenssel szintén színes vegyületet képeznek. A húskészítményekhez felhasználható különböző fűszerek színreakcióra gyakorolt hatását vizsgálva megállapítottam, hogy a bors, pirospaprika, fokhagyma, gyömbér, vöröshagyma, szegfűbors, szerecsendió és köménymag nem befolyásolta, a majoranna és mustármag viszont növelte a kék szín intenzitását.

4. Végül meghatároztam a két legnagyobb mennyiségben gyártott húskészítmény főzés utáni maradék foszfatázaktivitás határértékét. Sonkakészítmények esetében - mivel azok kémiai összetétele viszonylag állandó - a határérték 726 mmol fenol/ 1000g, 5 %-os elsőfajú hibavalószínűségre, egymintás ellenőrzés mellett. Vörösárukészítményekre azonban az ellenőrző rendszer rendkivül bizonytalan, mivel a különböző anyagok hatása a vörösáruk foszfatázaktivitására összetett és bonyolult. Vörösáruknál nagy mennyiségben használnak különböző fehérjealapú anyagokat, a hús helyettesítésére. Ezáltal a nagy foszfatázaktivitással rendelkező hús helyett a húshoz képest elhanyagolható aktivitással rendelkező anyagokat dolgoznak be a termékbe, így a nyers massza kezdeti aktivitása lecsökken, ami a főzés utáni maradék aktivitás csökkenéséhez vezet. A különböző anyagok befolyásolják továbbá az enzim hő hatására történő inaktiválódását is. Mivel a termékek összetétele a gyártmánylapokban engedélyezett változó anyagnormák miatt nem állandó, ezért foszfatázaktivitásuk is nagymértékben ingadozik. Az ingadozás oka lehet - az eltérő alapanyag-összetételen kívül - az eltérő mikrobiológiai szennyezettség is. Az ellenörző rendszer tehát vörösárukészítmények főttségének ellenőrzésére nem elég érzékeny, csak a durva hőkezelési hibák mutathatók ki.