MTA Kémiai Tudományok Osztálya
Felolvasóülés, 2013. június 18.

Vértessy Beáta
MTA TTK Enzimológiai Intézet
BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék

A DNS kémiája a bölcsőtől a sírig
 
Az előadás kivonata (pdf)
Az előadás diái (pdf)

***

Beszélgetés Vértessy Beátával

Az utóbbi évtizedben a DNS kémiája és a DNS-ben megjelenő uracil áll több projektjük középpontjában. Az emberben felvetődik, hogy miért van timin a DNS-ben, amikor talán uracil is lehetne helyette.

Már a középiskolában megtanuljuk, hogy az RNS-ben uracil van, a DNS-ben timin. A biokémia vizsgára már azt is meg kell tanulni, hogy a timidilát-bioszintézis nagyon bonyolult folyamat, rengeteg enzim, kofaktor és sok energia szükséges hozzá. Ennek nyomán bizonyára felmerül a hallgatókban a kérdés, hogy mire való ez a „nagy felfordulás”. Miért nem jó az uracil, amely az RNS-ben már bevált?

Ma leginkább azt a magyarázatot fogadjuk el, hogy a DNS-ben a hosszú távú információtárolás során problémát okoz, hogy a citozin uracillá dezaminálódhat, és ennek eredményeként „rossz” uracil jelenik meg. Ezt meg kell különböztetni a „jó” uraciltól, amely azért „jó”, mert adeninnel, és nem guaninnal képez kötést. Az evolúció a jó uracilra „kitalált” egy címkét – a metilcsoportot –, amivel megalkotta a timint. Ez tetszetős magyarázat, de nincs rá közvetlen kísérletes bizonyíték. A hipotézist akkor támaszthatnánk alá, ha találnánk olyan uraciltartalmú DNS-t, amelyben nincs timin. Kiderült, hogy ilyen is van, de egyelőre csak önálló életre képtelenvírusokban. Bizonyos bakteriofágok DNS-ében az adeninnel szemben uracil jelenik meg, és ezt a szokatlan DNS-t a gazdaszervezetben kell felépíteni, annak ellenállását legyőzve.

Akkor fordítsuk meg a kérdést: miért „elégszik meg” az RNS az uracillal?

Az RNS kisebb stabilitást igényel. Az ősi RNS-világban feltehetőleg nagyobb volt a mutációk előfordulásának valószínűsége.. A DNS megjelenésével – amikor a ribózgyűrűből kevésbé reaktív dezoxiribóz keletkezett – megindult az információ stabilzálása; a folyamat következő lépése lehetett a citozin-dezamináció kicselezése.

A DNS sem túl stabil. Vagy éppen annyira robusztus, amennyire kell?

Szeretjük azt gondolni, hogy a mi világunk a lehető világok legjobbika… Mindenesetre most egyensúly áll fenn, amely a különböző szervezetekben más-más fokot ér el. Például egy emlős méretű genomban naponta hozzávetőlegesen ezer módosulás keletkezik, ami elég nagy szám, de a szervezet viszonylag jól kijavítja a hibákat. Egyes mikroorganzimusokban sokkal nagyobb ez a módosulási ráta, és léteznek olyan patogén mikroorganizmusok, például a Mycobacterium tuberculosis, amelyek az antibiotikumok elleni rezisztenciában is kihasználják a megnövekedett mutációs rátát. A magas arányt úgy érik el, hogy már a polimerázok sem másolják nagyon hűen a DNS-t. Így nem őrzik meg a „saját fajtájukat”, hanem kis eltéréssel hoznak létre különböző genomi állományú törzseket, amelyek aztán kisebb-nagyobb sikerrel veszik fel a harcot az antibiotikumok ellen.

Ez a példa is azt a jelenséget illusztrálja – amely az előadásában hangsúlyt kapott –, hogy a hiba hasznos is lehet egy szervezet számára. Hogyan jöttek rá erre a meglepő fordulatra?

Egy folyamat vizsgálata során gyakori és jól alkalmazható technika, hogy kiütjük, eltávolítjuk a folyamatért felelős fehérjéket. Egy egérkísérlet során a kutatók megpróbálták eltávolítani az egyik fontos DNS-javító fehérjét, az uracil-DNS glikozilázt (az UDG-t, pontosabban ennek az enzimcsaládnak a leginkább hatékony képviselőjét). Arra számítottak, hogy nagyon megnő majd a mutációs ráta, de az egér nem mutatott a várakozásnak megfelelően súlyos fenotípust, viszont egy idő után immunológiai rendellenességek léptek fel. Tehát egy uracilkivágó enzim (az UDG) eltüntetése nem a hibagyakoriságot növelte főként, hanem immunológiai problémákat okozott: az egérben jelentősen csökkent az immunoglobulin gének variációja. A további kutatás megállapította: az immunoglobulinok sokszínűsége mögött olyan génátrendeződés húzódik meg, amely azon alapul, hogy a gén bizonyos régióiban egy enzim, egy aktiváció által indukált dezamináz „szándékosan” dezaminál citozinokat uracillá. Ezt az uracilt az uracil-DNS glikoziláz „kezelésbe veszi”: kivágja a DNS-szálból, s az ismétlődő akciók végén kettős száltörés következik be a DNS-ben. A kettős száltörés általában súlyos hiba, de itt jó helyen jelentkezik, mert a kiszabadított variábilis régiók új módon csatlakozhatnak egymáshoz. Az immunoglobulin gének variabilitása tehát részben olyan folyamatból ered, ahol a gének átdarabolódása sok uracil adott helyhez kötött megjelenése miatt következik be.

Amikor ezt a folyamatot – körülbelül egy évtizede – feltárták, megerősödött az az elképzelés, hogy a „hiba-felfogást” időnként át kell értékelni. Körülbelül másfél éve jelent meg néhány olyan cikk, amely azt kezdi tárgyalni, hogy az uracilra „kitalált” javítómechanizmus milyen szerepet játszik a fejlődésbiológiában, például a metil-citozinhoz kapcsolt epigenetikai jel felülírásában – abban, hogy a metil-citozinból metilmentes, „normális” citozin legyen. Rájöttek, hogy a metilcsoport eltávolítása javítómechanizmus útján történik. Ezt is egérben találták meg. Az előbb említettem az uracil-DNS glikozilázt, amely nagy enzimcsalád, és vannak olyan „elfajzott” verziói, amelyek nem is uracilt vágnak ki a DNS-ből, hanem timint. A timin-DNS glikoziláz, szerencsére, csak a guaninnal szemközti timint vágja ki, a „normális” timineket nem. Először sejtvonalakban ütötték ki a timin-DNS glikozilázt – és ez nem vezetett szignifikáns fenotípushoz. Utána kiütötték egérben is – ez már letálisnak bizonyult. Tehát a kisérletből kiderült, hogy a timin-DNS glikoziláznak olyan speciális funkciója van, amelyet csak az embrionális fejlődésben lehet észrevenni, a sejtvonalban már nem. Aztán megfigyelték, hogy a kiütés eredményeként nagyon megváltozott a citozin-metilcímke eloszlása. A későbbi kutatások pedig uracilszármazékok sokaságát tárták fel (pl. hidroximetil-, formil-, karboxi-uracilt), amelyek mind a metilcsoport eltávolítását, a „normális” citozin visszaállítását szolgálják.

A hibáról alkotott felfogás átértékelésében az Önök kutatócsoportja is jelentős felfedezéseket tesz, például az ecetmuslica-lárvák szöveteiben felhalmozó uracil jelző, „jeladó” szerepének kimutatásával.

Az előzményekhez tartozik egy korai cikk, amely leírta, hogy az ecetmuslicában nemigen figyelhető meg az uracil-DNS glikoziláz aktivitása. Ezt mások később megcáfolták, de az ecetmuslicát azért is érdekesnek tartották, mert egy publikáció szerint adUTPáznak – a dezoxiuridin-trifoszfát-nukleotid-hidroláznak, ennek az uracil-beépülés ellen küzdő fehérjének – van egy fehérje-inhibitora az ecetmuslicában. A felfedező kutatásban sokat segít, ha az ember fontos fehérjetermészetű inhibitort talál, mert akkor irányítva tudja gátolni a vizsgált fehérjét, általában sokkal specifikusabban, mint kis molekulákkal. Mi azzal a céllal vágtunk bele a kutatásba, hogy fehérjeinhibitort keressünk. Az ecetmuslicában ugyan nem találtunk ilyen fehérjét (egy másik rendszerben viszont igen), és kiderült az is, hogy itt nem egy fehérje gátolja a dUTPázt, hanem ez az enzim egyszerűen nem jelenik meg lárvaállapotban: a lárvális szövetek túlnyomó többségében a dUTPáz fehérje génje nem íródik át. Csak azokban az „imaginális korongokban” marad meg az expresszió, amelyek a báb állapotot túlélve az imágó, a kifejlett rovar szöveteit adják. A többi, lárvális szövetből nemcsak a dUTPáz hiányzik, hanem a javítóenzim, az UDG is. Eddigi ismereteink szerint ennek azt kell jelentenie, hogy az ecetmuslica genomjában sok uracil van (ami esetleg jelzi, hogy a feleslegessé váló lárvális szöveteket le kell majd bontani). Ezt a következtetést több alkalommal elmondtam a kollégáknak, de kétkedéssel fogadták… Valóban szokatlan, hogy a normális DNS-ben nagy mennyiségű uracil forduljon elő, mégpedig adott életszakaszban, nem átmeneti körülmények között. Ezért csak akkor fogadták el tőlünk ezt a levezetést – aminek a két enzim hiányából egyértelműen kell következnie –, amikor megmértük az ecetmuslica DNS-ében az uracilszintet, és azt találtuk, hogy a lárvákban egymillió bázisban akár ezer uracil is előfordulhat. Ez ezerszer több, mint normális esetben, amikor egy-két uracil jut egymillió bázisra. Most, hogy már tudjuk mérni az uracilszintet, nemcsak a lárvaállapotot, hanem más, jól elkülöníthető szöveteket, fejlődési állapotokat is tanulmányozhatunk különböző organizmusokban.

A DNS-beli uracil mérését (ami valósidejű PCR-alapú kvantitatív eljárás) egy okos kollégám (Horváth András) dolgozta ki, és mostanában olyan módszeren dolgozunk, amit szöveti festésre is tudunk használni. Ha ez működik, akkor valóban bármilyen szövetben feltérképezhetjük az uracil jelenlétét.

A laikus azt hinné, hogy a 21. században nem kell saját módszerekkel bajlódni, mert rengeteg műszer, eljárás áll már rendelkezésre…

Nálunk a leírt módszerek nem működtek. Az irodalomban javasolt MS–HPLC-módszer nem vált be. Nemrég egy norvég csoport is hasonló problémákról számolt be, mert az MS–HPLC alkalmazása előtti minta-előkészítés nagyon nehéz: nem mindegy, hogyan tárjuk fel a DNS-t, hogyan szabdaljuk: az uracil közben átalakulhat, a citozinokból ekkor is gyakran képződik uracil. Ők nagyon érdekes mintafeltárási módszert javasoltak, de a mi módszerünk – mivel polimeráz lácreakciót használunk – az általunk kiválasztott DNS-szegmensekben határozza meg az uraciltartalmat. Erre azért van szükség, mert nem tudjuk, hogy az uracil eloszlása véletlenszerű-e vagy sem, vannak-e olyan genomi régiók, ahol gyakrabban fordul elő az uracil, mint máshol.

Úgy gondolom, ritkaság, hogy valakinek akadémiai kutatóintézetben és egyetemen is van kutatócsoportja. Hogyan alakult ki ez a kettősség?

Nemrégiben lett két munkahelyem: a Műegyetemen egyetemi tanár vagyok, az MTA TTK Enzimológiai Intézetében pedig régóta vezetek egy csoportot. De az Enzimológián folyó munka mellett már régen elkezdtem a tanítást, nemcsak a Műegyetemen, hanem az ELTE-n is, doktori kurzusokat tartottam. Aztán a Műegyetemtől érkezett az a megtisztelő felkérés, hogy egyetemi tanárként is számítanának rám. Ennek elfogadásakor arra gondoltam, hogy ha az ember az oktatást és a kutatást össze tudja kapcsolni, a kettő kölcsönösen megtermékenyíti egymást. A csoportom fiatalokból áll, s ez valószínűleg így is marad: a diákok egy idő után elmennek külföldre, és újak érkeznek helyettük. A Műegyetemen az oktatásban veszek rész még intenzívebben, és itt sikerült létrehozni egy szerkezeti biológiai labort (http://www.biostruct.org/biostruct/), ahol részben a TTK-s kollégákkal dolgozom, de nagyon sok a PhD-diák is, aki az egyetemhez kötődik. Tehát nincs kétszer húsz kollégám, hanem azok, akik szerkezeti biológiával foglalkoznak a csoportomban, most több időt töltenek a Műegyetemen.

Amikor a Q2-be átköltözünk, sokkal közelebb lesz egymáshoz a két bázis. Ha a Természettudományi Kutatóközpont a Lágymányosra kerül, az ELTE, a Műegyetem és az MTA TTK között szerves kapcsolat alakul majd ki. Hatékonyabb lesz az infrastruktúra felhasználása, javulhat a kutatók egymás közötti kommunikációja és a diákok számára is kitágul világ. Egyértelműen pozitívnak tartom, hogy az akadémiai kutatás az egyetemi kampuszon folytatódik.

SV