Háromkomponensû biokonjugátumok szintézise érdekében munkám során célul tûztem ki [1.] olyan peptid származékok elõállítását, amelyek tartalmaznak detektálásra alkalmas molekularészletet (fluorofór, kelátképzõ) [2.], új ornitin tartalmú polimer polipeptid szintézisét és jellemzését; [3.] diszulfid híd kötést tartalmazó konjugátumok szintézisét, az optimális kapcsolási körülmények kidolgozását.

Munkám fontos célkitûzése volt annak felmérése is, hogy a polimer polipeptidek és konjugátumaik kémiai szerkezete és membrán-aktivitása között milyen összefüggés van. Ezért foszfolipid modell membránok felhasználásával tanulmányoztam [1.] a polimer polipeptidek mono- és kettõs-rétegre gyakorolt hatását, illetve a polipeptidek konformációját foszfolipid membrán jelenlétében [2.] a polimer polipeptidekhez kapcsolt oligopeptid befolyását a konjugátum membrán aktivitására.
 

I. Szintézis és jellemzés

I. Peptidek és jelzett peptid származékok szintézise és jellemzése

A peptidszintézis során N-terminálison ciszteint tartalmazó peptideket (CAVKDEL, CL és CTGRGDSP, CP) állítottam elõ, melyeket a peptid-polimer konjugátumok elkészítéséhez használtam fel. Jelzõmolekula-peptid konjugátumokat szintetizáltam a fluoreszcens sajátságnak Ox-OEt és/vagy a DTPAA kelátképzõ felhasználásával. A KDEL, AVKDEL, KAVKDEL peptidek N-terminális a - és/vagy e -aminocsoport(ok)on kialakított jelzett származékait szilárd fázisú szintézissel Boc/OcHex stratégia segítségével állítottam elõ. A hidrogén-fluoridos hasítás után a nyers termékek tisztasága - egyes DTPA-peptidek kivételével - minden esetben 90% felett volt, RP-HPLC tisztítás után pedig elérte a 95-99%-ot. A peptidek elsõdleges szerkezetét aminosav analízissel és tömegspektrometriával bizonyítottam.

A naOx-peptidek fluoreszcencia sajátságait tanulmányozva megállapítottam, hogy a fluorofór tulajdonságai nem változtak a szintézis, valamint a tisztítási folyamat után. A naOx-peptidek biológiai aktivitását a receptorral való kötodés fluoreszcens mikroszkópos vizsgálata során ellenõriztem. Kimutattam, hogy a jelzett peptid a citoplazmában, a sejtmag környezetében kialakuló granulumokban halmozódott fel. Ez jelezheti azt, hogy a jelpeptid az endoplazmás retikulum bizonyos részén elhelyezkedõ receptorához kötõdött, aktivitása megmaradt. Elõállítottam a DTPA-peptidek In³⁺-ionnal képzett komplexeit. 8-hidroxi-kinolin felhasználásával analitikai módszert dolgoztam ki, mely lehetõvé tette In³⁺-DTPA komplexek tisztaságának és stabilitásának jellemzését. Az eljárás alkalmazhatóságát spektrofotometriás, TXRF és VRK analízissel bizonyítottam. Munkám során igazoltam, hogy a szilárd fázisú szintézis a DTPA komplexképzõ sajátságait nem befolyásolta.
 
 

II. Elágazó láncú polimer polipeptidek szintézise és jellemzése

Az elágazó láncú polilizin gerincû polipeptidek közül az amfoter sajátságú, glutaminsavat tartalmazó variánst (EAK), polianionos (Ac-EAK), valamint két polikationos, a -amino-csoportokkal rendelkezõ, alanin-, illetve szerin-tartalmú (AK, SAK) származékot szintetizáltam. E korábban már leírt vegyületek mellett elõállítottam az eddig nem ismert, a- és e-aminocsoporttal egyidejûleg rendelkezõ, pozitív töltésû (OAK) polipeptidet is. A polimerizációfok és az átlagos moláris tömeg meghatározását követõen enantiomer összetétel vizsgálattal kimutattam, hogy a szintézis során számottevõ racemizáció sem a Ser, sem az Orn tartalmú polipeptid esetében nem következett be.

Adszorpciós kinetikai mérések és kompressziós izotermák felvétele alapján vizsgáltam a polipeptidek viselkedését a levegõ/víz határfelületen. Megállapítottam, hogy a vegyületek hidrofóbitása a szerkezetüktõl függõen változott az SAK>AK>EAK>Ac-EAK>OAK>polilizin sorrend szerint.
 

III. Peptid-polimer konjugátumok szintézise és jellemzése

SPDP reagens segítségével elõállítottam oligopeptid-polimer polipeptid konjugátumok három új csoportját. Kidolgoztam a szintézis optimális körülményeit. Elsõ lépésben azt vizsgáltam, hogy a polimer szerkezete (polilizin, AK, SAK, EAK) és a reakció körülmények (pH, SPDP/polimer moláris arány) hogyan befolyásolják az SPDP beépülésének mértékét. Megállapítottam, hogy a nukleofil reakcióban a polimerek összetétele, elsõsorban a láncvégi aminosavak /OH (SAK), COOH (EAK)/ minõsége kismértékben befolyásolja a szubsztitúció mértékét. A következõ lépésben az aktivált tiolcsoportot tartalmazó polimer polipeptideket és az oligopeptidet /CAVKDEL (CL) és CTGRGDSP (CP)/ reagáltattam. Ekkor azt tanulmányoztam, hogy a polimer és az oligopeptid szerkezete, valamint a reakció körülmények (pH, peptid/polimer moláris arány) változtatása hogyan befolyásolják a tiol-diszulfid csere hatékonyságát, a szubsztitúció mértékét. Az eredményekbõl arra következtettem, hogy a tiol-diszulfid csere lejátszódásához a savas pH a leginkább kedvezõ. Megállapítottam, hogy a polimerek oldallánc összetétele a peptid szerkezete a szubsztitúciófokot kismértékben befolyásolja.

A polikationos sajátságú AK És SAK, illetve az amfoter karakterû EAK polimert, illetve hidrofil CAVKDEL (CL), vagy hidrofób CFWRGDLVFDFQV (CV) peptidet tartalmazó konjugátumok sajátságait levegõ/víz határfelületen tanulmányoztam. Adszorpciós kinetikai vizsgálatok és kompressziós izotermák felvétele után megállapítottam, hogy a polikationos /(CL)AK, (CL)SAK, (CV)AK, (CV)SAK/, valamint negatív töltésû /(CL)EAK, (CV)EAK)/ konjugátumok stabil monoréteget képeznek a levegõ/víz határfelületen. A mért p_max értékek alapján a konjugátumok hidrofóbitása a (CL)AK>(CL)SAK>(CL)EAK, illetve a (CV)EAK>(CV)SAK>(CV)AK sorrenddel jellemezhetõ. Megállapítottam, hogy az azonos polimerek és konjugátumaik hidrofóbitását valamennyi esetben a (CV)polimer> (CL)polimer> polimer sorrend írja le. Ez arra utal, hogy a konjugátumok határfelületi viselkedését elsosorban a peptid aminosav összetétele határozza meg, a polimernek elsõsorban módosító szerepe van.
 

IV. A polimer polipeptidek és peptid-polimer konjugátumok kölcsönhatása foszfolipid modell membránokkal

A biológiai membránokkal való kölcsönhatás modellezése érdekében vizsgáltam, hogy a polikationos, e-, (polilizin), a- (AK, SAK), e- és a-aminocsoportot tartalmazó (OAK), amfoter (EAK), valamint polianionos (Ac-EAK) polimer polipeptidek milyen hatást gyakorolnak foszfolipidbol felépülõ rétegekre, illetve saját maguk milyen térszerkezeti változáson mennek át efféle rétegek jelenlétében. Tanulmányoztam továbbá, hogy a polipeptidhez kapcsolt, inkább hidrofil (CL), illetve inkább hidrofób (CV) karakter oligopeptid hogyan befolyásolja a polimer - membrán kölcsönhatást. A membrán modellek elõállításához neutrális DPPC-t, illetve a természetes membránok összetételét jobban közelítõ DPPC-t és anionos PG-t tartalmazó (95/5 és 80/20 mol/mol) foszfolipid keverékeket választottam.

IV.1. Kölcsönhatás foszfolipid monorétegekkel

A polimerek és a peptid-polimer konjugátumok penetrációs készségére a levegõ/víz határfelületen kialakuló foszfolipid monorétegek vizsgálatakor következtettem. A felületi nyomás (penetrációs kinetikai vizsgálatok), valamint az egy molekulára jutó terület (kompressziós izotermák) változása alapján a polimerek foszfolipid monorétegekkel való kölcsönhatásának erossége az SAK>AK>EAK>Ac-EAK >polilizin>OAK sorrenddel jellemezhet[.

A p_max értékeket összehasonlítva elmondható, hogy a polipeptidek foszfolipid monorétegekkel való kölcsönhatásában - az oldalláncvégi aminosav töltésétõl (pozitív/ /neutrális/negatív) és a töltéssel rendelkezõ csoport elhelyezkedésétol (a- vagy e-aminocsoport) függõen - elsõsorban elektrosztatikus (polilizin, OAK), illetve elektrosztatikus és hidrofób erõk (AK, SAK, EAK, Ac-EAK) játszhatnak szerepet. A peptid-polimer konjugátumok esetében a foszfolipid monorétegekbe való beépülés mértéke - egyezõen a hidrofóbitás vizsgálatok eredményével - a (CL)AK>(CL)SAK> >(CL)EAK, illetve (CV)EAK>(CV)SAK> (CV)AK sorrenddel írható fel. A konjugátumok viselkedését az azonos polimerével összehasonlítva megállapítható, hogy a hidrofil CL peptid nem (EAK), vagy csak kismértékben (AK, SAK), míg a hidrofób CV peptid nagymértékben növelte a penetrációs készséget.
 

IV.2. Kölcsönhatás foszfolipid kettõsrétegekkel

A membrán külsõ felszínén, illetve az alkilláncok régiójában elhelyezkedõ fluoreszcens molekulával (ANS, DPH) jelzett liposzómák sajátságainak (intenzitás, polarizáció) mérésébol következtettem a foszfolipid kettõsrétegben polimer polipeptidek, illetve konjugátumok jelenlétében bekövetkezõ változására (fluiditás, penetráció). Az eredmények arra utalnak, hogy a polimer polipeptidek nem (AK, SAK, EAK, Ac-EAK), vagy csak kismértékben (polilizin, OAK) befolyásolták a DPPC/PG (95/5 mol/mol) liposzómák foszfolipid kettõsrétegének fluiditását. A PG tartalom emelésekor a penetráció jelentõs mértékben növekedett, amit a T_c polilizin jelenlétében bekövetkezo növekedése is mutatott. A CL És a CV peptidet tartalmazó konjugátumok mind a poláris felszínen (ANS), mind a hidrofób belsõ régióban (DPH) a membrán fluiditás kisebb /(CL)polimer konjugátumok/, vagy jelentosebb /(CV)polimer konjugátumok/ mértékének csökkenését okozták.

A polimerek, illetve a konjugátumok konformációja liposzómák jelenlétében megváltozhat. Ezért megvizsgáltam e vegyületek oldatbeli térszerkezetét CD spektroszkópia segítségével, eltérõ liposzóma mennyiségek jelenlétében. A CD spektrumok alapján megállapítható, hogy liposzómák jelenlétében a rendezett polimer polipeptidek (SAK, Ac-EAK) megtartották a pufferben felvett szerkezetüket, a rendezetlen makromolekulák szerkezete változatlan maradt (polilizin), vagy - foszfolipid összetételtol függõen - rendezettebbé vált (AK, OAK, EAK). A (CL)- és (CV)polimer konjugátumok mind pufferben, mind DPPC, illetve DPPC/PG tartalmú liposzómák jelenlétében az alkotó polimer polipeptid (AK, SAK, EAK) szerkezetétõl és oldatbeli konformációjától függetlenül rendezett szerkezetet vettek fel. Ez arra utal, hogy a konjugátumok oldatbeli konformációjának kialakításában az oligopeptid dominált.

A mono- és kettõsrétegekkel végzett vizsgálatok eredményeit összegezve megállapítható, hogy a polimer polipeptidek és foszfolipidek között kölcsönhatás mértéke a polimer töltésétõl, kationos polipeptidek esetében az aminocsoport típusától (a/e), illetve az oldalláncvégi aminosav természetétõl függ. A polimer polipeptidek modell membránokhoz való kötodésének fõ hajtóereje az e -amino- csoportot tartalmazó polipeptideknél (polilizin, OAK) elektrosztatikus hatás, melyhez hidrofób erõk is hozzájárulhatnak (AK, SAK, EAK, Ac-EAK). Mivel a konjugált molekulák orientációja és a szubsztitsciófok megegyezett, megállapítható, hogy a peptid szerkezeti tulajdonságai (aminosav összetétel, töltés, hidrofóbitás) játszanak döntõ szerepet a konjugátum - foszfolipid kölcsönhatásban, melyet a makromolekula jellemzõi módosíthatnak.

Hálásan köszönöm Dr. Hudecz Ferenc kutató professzornak, az MTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoport vezetõjének, munkám témavezetõjéként nyújtott értékes, útmutató tanácsait, türelmét, észrevételeit, amelyekkel segítségemre volt a téma kidolgozásában és a dolgozat elkészítésében. Köszönöm Dr. Francesca Reig Isart kutató professzornak (CID, CSIC Department of Peptide and Protein Chemistry, Barcelona, Spain) és Dr. Maria Asunción Alsina egyetemi tanárnak (Department of Pyhysicochemisty, Faculty of Pharmacy, Barcelona, Spain), hogy laboratóriumukban munkámat lehetõvé tették. Köszönetet mondok az ELTE Peregrinatio II. Alapítvány, az OMFB Spanyol-Magyar Kormányközi Együttmûködési Program (3/1995) és az OTKA (T-014964), valamint az ETT (115/1996) támogatásáért.

For development and rational design of three-component bioconjugates [1.] peptides and peptide derivatives containing a ‘reporter’ moiety (fluorescent or chelating agent); [2.] branched chain polypeptides and [3.] conjugates formed by disulphide linkage were synthesised. In order to establish correlation between structural properties (charge, composition, conformation) of the macromolecular component and to determine the effect of the conjugated peptide on membrane activity, penetration capability was studied.

HS-peptides (CAVKDEL, CL and CTGRGDSP, CP) and labelled peptide derivatives containing N^a - (Ala, Lys) and/or N^e - (Lys) 2[1]-naphtyl-5(4H)-oxazolone (naOx) and/or diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA) were synthesised with Boc/OcHex strategy, characterised by amino acid composition and FAB-MS. The fluorescent feature and receptor binding ability of naOx-peptides documented by fluorescent spectroscopy/microscopy were maintained after the synthesis. Applying 8-hydroxy-quinoline, a new analytical method was developed for the preparation, purification and characterisation of In³⁺-DTPA-peptide complexes. As it was verified by thin layer chromatography, UV and TXRF spectroscopy the synthetic procedure used had no influence on chelating properties of DTPA.

Polylysine and its branched chain derivatives /general formula poly[Lys(DL-Ala_m-X_i)], (XAK), m~3, I<1/ with amphoteric (X=Glu, EAK), polyanionic (X=Ac-Glu, Ac-EAK) or polycationic character, containing a- (X=z, AK; X=Ser, SAK) or a- and e-amino groups (X=Orn, OAK) were synthesised. After determination of the average degree of polymerisation and average relative molecular mass, the Ser/Orn enantiomer composition of respective polypeptides was quantified. After derivatization with 1-fluoro-2,4-dinitrophenyl-5-L-alanine no essential racemization could be documented by HPLC chromatograms. The relative hydrophobicity of polypeptides was found to be dependent on the structure and shows the following order: SAK>AK>EAK>Ac-EAK>OAK>polylysine.

For the synthesis of HS-peptide - polypeptide (AK, SAK, EAK) conjugates the amide-thiol heterobifunctional reagent, 3-(2-pyridyldithio)propionic acid N-hydroxy-succinimide ester (SPDP) was applied. The effect of chemical structure (amino acid composition, charge, conformation) of polymer/HS-peptide (CL or CP) and reaction conditions (pH, molar excess) on the average degree of substitution was studied. UV spectroscopic data indicate, that the amino acid composition and the side chain structure of the polymers, essentially the N-terminal amino acid /OH (SAK), COOH, (EAK)/ had some influence on the SPDP substitution. As it was revealed by UV spectroscopic and amino acid analysis, the chemical structure of the polymer/peptide had moderate effect on disulphide bond formation between HS-peptides and thiol-containing polymers, which is more pronounced at pH 6.

With this method the hydrophilic CL and the hydrophobic CFWRGDLVFDFQV (CV) peptide was coupled to AK, SAK or EAK. According to p_max values obtained at the air/water interface, for the hidrophobicity of conjugates the following order was established: (CL)AK>(CL)SAK>(CL)EAK and (CV)EAK>(CV)SAK>(CV)AK. The (CV)polymer > (CL)polymer > polymer hydrophobicity order indicates that surface properties of the conjugates is determined mainly by the hydrophilic/hydrophobic character of the peptide.

These polymers and conjugates interact with phospholipid monomolecular layers composed of DPPC or DPPC/PG (95/5, 80/20 mol/mol). Surface pressure (penetration kinetic measurements) and area/phospholipid molecule values (compression isotherms) indicated that insertion into lipid monolayers - depending on the charge (positive/negative/ /neutral) and the position of the charged group (a- or e -amino group) - is mainly driven by electrostatic (polylysine, OAK) or electrostatic and hydrophobic (AK, SAK, EAK, Ac-EAK) forces. The conjugate penetration can be characterised by (CL)AK>(CL)SAK>(CL)EAK or (CV)EAK>(CV)SAK)> (CV)AK order. Our data also indicated that the hydrophilic CL peptide had no (EAK) or moderate (AK, SAK), whereas the hydrophobic CV peptide had significant increasing effect on the insertion ability of the polymers.

The interaction between branched polypeptides/conjugates and phospholipid membranes was further investigated using DPPC/PG (95/5, 80/20 mol/mol) lipid bilayers and fluorescent probes located either at the polar surface (ANS) or within the hydrophobic core (DPH) of the liposome. Polypeptides had no (AK, SAK, EAK, Ac-EAK) or moderate (polylysine, OAK) influence on the fluidity of the surface region (ANS) and/or hydrophobic core (DPH) of the DPPC/PG (95/5 mol/mol) liposomes. Significant increase in fluorescence intensity and in polarisation was observed when DPPC/PG (80/20 mol/mol) liposomes were used. Changes in the fluorescence intensity and in polarisation of fluorescent probes (ANS and DPH) suggested that all conjugates interact with the outer layer of the membrane to a lesser degree [(CL)polymer conjugates] or considerably [(CV)polymer conjugates]. Marked penetration was documented by a significant increase of the transition temperature only with the (CV)EAK compound. For polypeptides with ordered conformation (SAK, Ac-EAK) in buffer no significant conformational changes were observed. CD spectra of unordered polymers recorded in the presence of DPPC and DPPC/PG (95/5, 80/20 mol/mol) liposomes indicated no changes (polylysine) or significant increase in a -helix content (AK, OAK, EAK). The conjugates - independently form the structure of the polymer - adopted ordered conformation under the same conditions.

Taken together data obtained from mono- or bilayer experiments suggest that the interaction between branched polymers and phospholipid membranes are highly dependent on the charge properties (Ser vs. Glu), on the identity (Ser vs. Ala) of side chain terminating amino acid and on the position of the charged amino group (a/e ). The binding of polymers to the model membranes could be mainly driven by electrostatic forces (polylysine, OAK with e -amino groups), but the significant role of hydrophobic properties cannot be excluded (AK, SAK, EAK, Ac-EAK). Considering that the orientation and number of attached molecules to branched polypeptides were almost identical, we can conclude that the structural characteristics (amino acid composition, charge, surface activity) of the CL/CV peptides have a more pronounced effect on the conjugate - phospholipid membrane interaction.
 
 

Publications
1. Mezõ, G., Kajtár, J., Nagy, I., Szekerke, M., Hudecz, F.: Carrier design: Synthesis and conformational studies of poly[L-lysine] based branched polypeptides with hydroxyl groups. Biopolymers, 42: 719-730 (1997)
2. Garcia, M., Nagy, I.B., Alsina, A., Mezõ, G., Reig, F., Hudecz, F., Haro, I.: Analysis of the interaction with biomembrane models of HAV-VP3(101-121) sequence conjugated to synthetic branched polypeptide carriers with poly[L-lysine] backbone. Langmuir 14: 1861-1869 (1998)
3. Nagy, I.B., Haro, I., Alsina, A., Reig, F., Hudecz, F.: Interaction of branched chain polymeric polypeptides with phospholipid model membranes. Biopolymers, 46: 169-179 (1998)
4. Nagy, I. B., M‡k, M., Varga, I., Kov‡cs, J., Fellinger, E., Hudecz, F.: Solid phase synthesis of KDEL peptides labelled with fluorophore and/or bifunctional chelating agent for receptor localisation. In: Innovation and Perspectives in Solid Phase Synthesis & Combinatorial Libraries, 1998 (Ed. Epton, R.) Mayflower Ltd, Birmingham, UK (1999), pp 229-230.
5. Nagy, I.B., Reig, F., Alsina, M.A., Szõgyi, M., Hudecz, F.: The effect of attached peptide on branched poly-e-amino acid conjugate - phospholipid interaction. In: Peptides 1998. Proc. 25^th European Peptide Symposium, (Ed.: Bajusz, S., Hudecz, F.) 1999, AkadŽmiai Kiad—, pp. 438-439.
6. Sospedra, P., Nagy, I.B., Haro, I., Mestres, C., Hudecz, F., Reig, F.: Interaction of polylysine-[HAV-VP3 peptide] constructs with DPPC mono- and bilayers. Biomed. Chromatography 13: 1-2 (1999)
7. Sospedra, P., Nagy, I.B., Haro, I., Mestres, C., Hudecz, F., Reig, F.: Physicochemical behaviour of polylysine[HAV-VP3 peptide] constructs at the air-water interface. Langmuir 15: 5111-5117 (1999)
8. Nagy, I.B., Alsina, M.A., Haro, I., Reig, F., Hudecz, F.: Phospholipid - model membrane interactions with branched polypeptide conjugates of a hepatitis a virus peptide epitope. Bioconjugate Chemistry, 11: 30-38 (2000)
9. Nagy, I.B., Dancs, A., Mezõ, G., Hudecz, F.: Conjugation of HS-oligopeptides with polymeric branched chain polypeptides containing multiple amino groups. J. Bioactive and Compatible Polymers 15: 139-154 (2000)
10. Nagy, I.B., Majer, Zs., Hudecz, F.: Effect of phospholipid bilayers on solution conformation of branched polymeric polypeptides and peptide-polymer conjugates. Biopolymers (2000) (in press)
11. Nagy, I.B., Varga, I., Hudecz, F.: Preparation method of In(III)-labelled DTPA-peptides purified by 8-hydroxy quinoline. Analytical Biochemistry (2000) (in press)