Az önálló tudományágat jelölõ "biokémia" elnevezés a XX. század elsõ éveiben terjed el hirtelen. Az Ergebnisse der Physiologie két része, a Biophysik és a Biochimie 1902-tõl jelenik meg. Ugyanebben az évben indul a Zeitschrift für Allgemeine Physiologie, amelyet a sejt kémiájának szentelnek. 1905-tõl adják ki a Journal of Biological Chemistryt, 1906-tól a Biochemical Journalt és a Biochemische Zeitschriftet.
A modern biokémia kezdetét többnyire 1896-tól számítják. Eduard Buchner ekkor sajtolt ki olyan "levet" az élesztõbõl, amely erjedést indított el. Buchner azonban nem fogalmi, hanem technikai szempontból állt elõ újdonsággal; megmutatta, hogy az, amit sokan lehetségesnek véltek, valóban az. Csaknem negyven évvel korábban, amikor Louis Pasteur nem tudott ilyen folyadékot elõállítani, arra a megállapításra kényszerült, hogy az erjedés kémiája "élettevékenységgel kezdõdik és végzõdik". Ugyanakkor azt is kijelentette: nem érti, miért gondolják róla, hogy zavarba esne, ha kiderülne, hogy a cukorból élõ sejtek nélkül is keletkezhet alkohol.
Pasteur kényszerû vitalizmusa után merült fel annak a bonyolult fehérjének a gondolata, melynek kémiai reakcióit csak a sejtek "tudják" elvégezni, a vegyészek nem. Thomas Huxley a protoplazmát tekintette az élet alapjának. Többen óriási molekulának képzelték a protoplazmát., amelynek oldalláncai instabil csoportokat tartalmaznak. Ezek a csoportok különbözõ anyagcsere-funkciókat töltenek be, és speciális reakciókat váltanak ki. A protoplazma tehát az életfolyamatokat fenntartó "szervezett fermentum", szemben a szervezetlen fermentumokkal, amelyek a sejtektõl elválasztva is mûködhetnek. Ezeket nevezte el 1877-ben Willy Kühne enzimeknek.
A protoplazma-elmélet híveinek azonban gondot okozott,
hogy Buchner protoplazmától mentes folyadéka a cukrot
etanollá és szén-dioxiddá alakította
át. Buchner híres kísérletével csaknem
egy idõben mutatta ki Arthur Croft Hill, hogy a szervezetlen fermentumok
szintetikus reakciókat indíthatnak el. Arthur Harden az 1900-as
évek elején kezdte feltárni az élesztõnedvvel
kiváltott erjedési reakciók lépéseit.
A következõ néhány bekezdés az õ
munkájukba szeretne bepillantást nyújtani.
Habzott, mint a frissen csapolt sör
A XIX. század végén, 1897-ben egy többé-kevésbé
ismeretlen vegyész publikált egy cikksorozatot, amelyben
kimutatta, hogy az élesztõbõl kisajtolható
olyan lé, amely a cukrot alkohollá és szén-dioxiddá
alakíthatja át.
Eduard
Buchner 1860-ban született Münchenben. Adolf
von Bayernél tanult szerves kémiát; 1888-ban doktorált.
Bátyja javaslatára kezdett el az élesztõsejtek
felszakításával foglalkozni, de csak 1896 végén
végezte el híres kísérletét, miközben
bátyja laboratóriumában "vakációzott".
A két testvér azt vizsgálta, hogy az élesztõbõl
kivont folyadék nem pusztítja-e el a baktériumokat.
Az egyik kolléga javaslatát követve Buchner azt tapasztalta,
hogy ha egy rész homokot és egyötöd rész
kovaföldet ad az élesztõhöz, és a kedetben
csontszáraz keveréket mozsárban összezúzza,
perceken belül sötétszürke, tésztaszerû
massza keletkezik. Az erõs vászonba tekert masszából
azután hidraulikus sajtóban préselte ki a folyadékot.
Buchner a könnyen bomló folyadékot tömény cukoroldatba öntötte – hogy tartósítsa. Megrökönyödve vette észre, hogy a folyadék hamarosan úgy habzott, mint a frissen csapolt sör. Buchner akkoriban nem az erjedést tanulmányozta, de azonnal felismerte a jelenség fontosságát.
A szenzációs felfedezésrõl 1897-ben számolt
be "Alkoholos erjedés élesztõsejtek nélkül"
címû cikkében. Az alkoholképzõdést
kiváltó anyagot zimáznak nevezte, noha a nevet Antoine
Béchamp jóval korábban "lefoglalta" annak a fermentumnak,
amely a szacharózt glükózzá és fruktózzá
hidrolizálja. Buchner 1907-ben Nobel-díjat kapott "biokémiai
kutatásaiért és a sejtmentes fermentáció
felfedezéséért". Mai ismereteink szerint a cukor 14
lépésben alakul át etanollá és szén-dioxiddá,
s mindegyik reakciót más enzim katalizálja. Az is
kiderült, hogy az ép sejtek az egyes lépéseket
olyan pontossággal szabályozzák, amilyet a szervezett
sejteken kívül nem tudunk megvalósítani.
A maltóz szintézise
Buchner felfedezése idején egy fiatal londoni orvos,
Arthur Croft Hill azon gondolkozott, hogyan mehetnek végbe a szintetikus
folyamatok az élõ szervezetekben. Kizárólag
elméleti megfontolások alapján hipotézist állított
fel a sejten belüli fermentumok (vagyis az enzimek) mûködésére,
de kísérleti bizonyításra szorult, hogy az
enzimfolyamatok megfordíthatók és az anyagcsere szintetikus
folyamatai a kémiai egyensúly irányában zajlanak,
nem pedig az ellenkezõ irányban – az életerõ
hatására –, ahogyan sokan gondolták akkoriban.
Hill 1863-ban született Londonban. Tanulmányait Londonban és Cambridge-ben folytatta, dolgozott a londoni St. Bartholomew's Hospitalban, Bernben, majd ismét Londonban, a Royal Institution Davy–Faraday laboratóriumában. Kísérletei ma már unalmasnak tûnnek, de az 1890-es években roppant fontosak voltak. Hill kimutatta, hogy amikor a maltóz glükózzá hidrolizál a maltáz hatására tömény oldatban,
maltóz + víz —> 2 glükóz,
a reakció nem játszódik le teljesen, aminek az az oka, hogy két glükózmoleka egy reverzibilis folyamatban összekapcsolódik, s az oldatban a szintézis és a hidrolízis kémiai egyensúlyra vezet.
Abban az idõben mások is vizsgálták, hogy az enzimmel katalizált hidrolízisek megfordíthatók-e. O'Sullivan és Thompson a szacharóz hidrolizését tanulmányozta, és azt találta, hogy az az invertáz, amely a saját tömegénél százezerszer nagyobb tömegû szacharóz hidrolízisét váltja ki, a reakció után is aktív marad, és a nádcukor invertázzal elindított hidrolízise egyszerû kémiai reakció, amely nem különbözik számottevõen a szervetlen kémiai reakcióktól. A fordított folyamatot, amelynek során a glükózból és a fruktózból keletkezik szacharóz, nem sikerült kimutatni, de Hill úgy gondolta, ez annak tudható be, hogy a fordított reakció nagyon kis mértékben zajlik csak le. Hill magyarázata szerint a maltóz hidrolízisekor két azonos molekula keletkezik, szemben a szacharózéval, és így a hidrolízis termékének "gátló hatása" könnyebben megfigyelhetõ, mint a szacharóz esetében. Bár ez az indok nem állja meg a helyét, a maltóz hidrolízisének egyensúlyi állandója százhatvanszor kisebb, mint a szacharózé, tehát Hillnek végeredményben igaza (is) volt.
Hill az enzim, invertáz és maltáz szavakat 1898-ban szigorú definíció nélkül használhatta. A maltázt ebben az idõben élesztõbõl vonták ki. Hill a reakciót a minták redukáló képességének változásával és polarimetriával követte nyomon. Megállapította, hogy ugyanazt az egyensúlyi pontot érte el, amikor a maltózt hidrolizálta glükózzá, mint amikor a "glükóz szintetizálódot maltózzá", és hogy az egyensúly a koncentráció függvénye. Elsõ dolgozatában, érdekes módon, nem adta meg a maltóz hidrolízisének egyensúlyi állandóját. Ez az érték arra utalt volna, hogy nagy glükózkoncentráció esetén a reakció jelentõs mértékben megfordítható. Adatai alapján az értékre 20 M adódik. A gondot az okozza, hogy a mai becslések szerint ez az érték 880 M körüli (a szacharóz hidrolízésére 1,4 · 105 M), ami mellett nem valószínû, hogy jelentõs mennyiségû maltóz keletkezne a glükózból.
Annak bizonyításához, hogy valóban maltóz
keletkezett, elõ kellett állítani a cukor oszazon-származékát,
és meg kellett mérni a termék olvadáspontját.
Késõbb, amikor Hill nemcsak az élesztõbõl
származó maltáz "szintetikus képességét"
vizsgálta, rájött, hogy sok más termék
is keletkezik; ezeket bióznak és revertóznak nevezte
el. Elképzelhetõ, hogy a reakcióban különbözõ
oligoszacharidok is képzõdtek, és a felhasznált
enzimek sem voltak tiszták. Azt is tudjuk ma már, hogy a
maltóz és sok más molekula bioszintézise a
hidrolízis megfordításánál sokkal bonyolultabb
reakciókkal játszódik le. Ezek az alternatív
reakcióutak fokozott sejtszabályozást tesznek lehetõvé,
és elõsegítik, hogy a szintézis a kiindulási
anyagok kis koncentrációja mellett menjen végbe.
Analógiák
Buchner megfigyelte, hogy az élesztõlével kiváltott
szén-dioxid-fejlõdés jóval a cukor elfogyasztása
elõtt is csökken, de felforralt élesztõlé
adagolásával újra fokozható. Harden és
Young 1906-ban azt tapasztalta, hogy a folyamat mindig akkor játszódik
le, ha a felforralt folyadékban foszfátionok is vannak. Késõbb
azt is kimutatták, hogy ha oldódó, szervetlen fosztátot
adnak a glükóz és az élesztõlé
keverékéhez, az erjedés sebessége azonnal megnõ,
majd hamarosan visszatér a szokásos értékre.
A többlet szén-dioxid és alkohol mennyisége megfelelt
a foszfát mennyiségének, és a foszfát
olyan vegyületté alakult át, amelyet magnéziaeleggyel
(magnézium-klorid és ammónium-klorid ammóniás
oldatával) nem tudtak kicsapni.
A cukor-foszfát-észtert végül is a következõ három észterként azonosították: glükóz-6-foszfát (Robinson-észter), fruktóz-6-foszfát (Neuberg-észter) és fruktóz-1,6-difoszfát (Harden–Young-észter). Felhalmozódásukat "turbó-hatásnak", az anyagcsere-folyamatokba belépõ szubsztrátok kezdeti aktivációjának tulajdonítják. Mai ismereteink szerint a kipréselt lében a szervetlen foszfát hatására keletkezõ ATP-t azonnal felveszi a hexokináz vagy a foszfo-fruktokináz, s glükóz- és fruktóz-6-foszfát elõállítására használja fel. Ezért kiürül a szervetlen foszfát-tartalék, amely a további ATP elõállításához szükséges. Szervetlen foszfát nélkül a szén-dioxid fejlõdését a hexóz-foszfát-hidrolízisbõl származó szabad foszfát segíti elõ.
Arthur
Harden 1865-ben született Manchesterben. Henry Roscoe-nál,
majd Erlangenben Otto Fischernél tanult kémiát. Manchesterbe
visszatérve tanításba és tankönyvírásba
kezdett. A századforduló táján megszûnt
az a posztgraduális egészségügyi képzés,
amelyben részt vett, és teljes idejét a kutatásnak
szentelhette.
1929-es Nobel-elõadásában elmondta, hogy Macfadyen egyik kísérlete vezetett ahhoz a felfedezéshez, hogy a foszfátok fontos szerepet játszanak az alkoholos erjedésben. Macfadyen antizimázt akart elõállítani úgy, hogy élesztõlevet injekciózott az állatokba. Érdekes módon ennek a kísérletnek ugyanaz volt a célja, mint annak a korábbi vizsgálatnak, amelyben Buchner is részt vett, amikor a zimázt felfedezte. Az antizimáz elõállítása annak a programnak egy része volt, amelynek során gyógyhatású antiendotoxinokat akartak kinyerni a toxinokból (a zimáz itt azt az enzimet jelenti, amelyet Buchner kivonni vélt az élesztõbõl). Azt remélték (tévesen), hogy ezeket az anyagokat kinyerhertik a patogén mikroorganizmusokból.
Macfadyen azt javasolta Hardennek, hogy a cukrok bakteriális erjesztésének vizsgálata alapján keressen diagnosztikai módszert az egyes baktériumtörzsek megkülönböztetésére. A diftéria és a tetanusz bacilusa által kiválasztott toxinok alapján ugyanis arra gondoltak, hogy minden fertõzõ betegséget kémiai toxinok okoznak, és a betegségeket az immun szérumokban levõ antitestekkel gyógyíthatják. Ezért Macfadyen a Buchner testvérekhez hasonlóan megõrölte a baktériumokat, hogy kivonja a sejtnedveket. Buchner felfedezése a kovaföld és a nagynyomású prés alkalmazásának köszönhetõ: a sejtnedvet így sikerült hígítatlan formában kinyerni. Harden és Young is új eljárást használt. A két kutató volumetriás módszerrel követte a szén-dioxid fejlõdését (a korábban szokásos gravimetria helyett), és így szinte folyamatosan megfigyelhette az szervetlen foszfor hatására idõszakosan megnövekvõ zimáz-aktivitást.
Harden és Young azt is észrevette, hogy a glükóz élesztõlével elõidézett erjesztését – a foszfáton kívül – egy "dializálható anyag" is befolyásolja, amely hõ hatására nem bomlik el. Errõl az anyagról csak az 1930-as években derült ki, hogy több vegyület keveréke, amelyek közül a NAD a legfontosabb.
Az Endeavour nyomán